原位杂交检测味蛋白及转导蛋白味蕾的表达
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作者：杨慧 徐群渊 Roper S Chaudhari N
单位：杨慧 徐群渊(首都医科大学，北京市神经科学研究所，北京100054)；杨慧 Roper S Chaudhari N(Department of Ph ysiology and Biophysics,University of Miami School of Medicine,Miami FL33101,USA)
关键词：味蛋白；转导蛋白；原位杂交；味觉
解剖学报00zk11
【摘要】目的 利用原位杂交检测味细胞中G蛋白的表达。 方法 分别用RT-PCR方法克隆大鼠味蛋白及(α-rod)转导蛋白的全长cDNA，制 备地高 辛标记的正义链及反义链探针。结果 原位杂交分析了150个大鼠味蕾 ， 结果显示味蛋白和转导蛋白在舌味蕾细胞中都有表达。但两种蛋白标记细胞数量有明显差别 。每个味蕾大约有1.2个转导蛋白阳性细胞，占总味蕾细胞的0.8%；而每个味蕾平均有6. 2个味蛋白阳性细胞，占总味蕾细胞的4.1%；即味蕾中味蛋白阳性细胞大约是转导蛋白阳性 细 胞的5倍。转导蛋白探针对味蛋白mRNA无交叉杂交反应。在视网膜上可见转导蛋白基因的高 度 表达，而无味蛋白的表达。结论 味蛋白和转导蛋白可能是味细胞的G -蛋白，但以味蛋白特异性表达为主，它们可能参与味觉的信号转导作用。
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【中图分类号】Q189 【文献标识码】A 【文章编号】0529-1356(2000)-增-41
IN SITU HYBRIDIZATION DETECTION OF GUSTDUCIN AND TRANSDUCIN EXPRESSION IN TASTE BUDS
YANG Hui，XU Qun-Yuan
(Beijing Institute for Neuroscience，Capital University of Medical S ciences，Beijing 100054， China；)
ROPER Stephen，CHAUDHARI Niru pa
(University of Miami School of Medicine，Miami FL33101，USA)
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【Abstract】Objective The in situ hybridiza tio n method was used with signal amplification system for detecting G-protein expr ession in taste buds.Methods The gene of gustducin and α-ro d tr ansducin in rat are cloned by RT-PCR.Their sense and antisense probes were labe l ed with digoxigenin.About 150 taste buds in rat vallate and foliate papillae wer e analyzed.Results The results showed that there were 1.2 tra n sducin-positive cells and 6.2 gustducin-positive cells counted in each taste b ud profile on average.The number of gustduin-positive cells was approximately fiv e times more than transducin-positive cells in taste buds.There were 4.1% gustd u cin-positive cells and 0.8% transducin-positive cells in all taste cells.It c ou ld not be seen any cross reation of transducin probe to gustducin target.The hi gh expression of transducin in retina was also observed but no gustducin express ion could be detected.Conclusion The result of present study p roved that both transducin and gustducin were taste G-protein and gustducin was high expressed.Both of them might be involved in taste signal transduction.
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【Key words】Gustducin;Transducin;in situ hyb ridization;Taste
一般认为，哺乳动物能感受5种基本味质，即甜、苦、酸、咸、鲜[1 ]。生理学研究 表明，不同味感受器对不同的味质选择性地产生反应[2，3]但反应模式不甚相同， 其中，酸和咸味质通过味感受器细胞膜上特异性的H+和Na+离子通道使细胞去极化；甜 、苦和鲜味质则通过GTP-结合蛋白和具有7个跨膜区的受体进行信号转导[4，5]。 已知味蛋白(gustducin)是一种味觉特异性G-蛋白[6]，专门表达于舌味蕾细胞而 不 表达于其他细胞。已有研究证明，味蛋白与主要参与视觉信号转导的转导蛋白(transducin) 有很高的同源性[7]，是两种相似的G-蛋白。因此，我们认为它们应该都能够选择 性地表达于味蕾细胞上，并可能是苦味、甜味和鲜味信号转导反应的重要成分[8] 。
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为进一步证实这一设想，我们利用高敏感度的原位杂交手段来检测味蛋白和转导蛋白在大鼠 舌味蕾的分布，希望能显示味细胞在表达上述两种G-蛋白数量上的差别，以便深入探讨它 们在味觉感受机制中的作用。
材料和方法
1.cDNA 克隆和RNA探针
选用大鼠舌的轮廓乳头和叶状乳头组织以及大鼠视网膜组织，提纯这些组织的mRNA(采用Inv itrogen公司的Fast Track药盒)，通过逆转录酶(GIBCO BRL 公司)合成cDNA。其中，根据大 鼠味蛋白序列83-232位氨基酸设计上游和下游PCR引物[6]，进行RT-PCR。将PC R产生的1.37kb的基因片段克隆进入PKS载体(Stratagene公司)。另外，按照小鼠α-rod转 导蛋白序列6-347位氨基酸设计PCR引物[7]，再克隆1.03kb的基因片段进入PKS载 体。将上述两种基因克隆进行DNA序列分析。
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上述两种基因的载体，经过线性化处理，在T7RNA聚合酶催化下，转录合成地高辛标记的 正 义链和反义链RNA探针(Roche公司的核酸标记检测试剂盒)。利用梯度倍比稀释法，将不同浓 度的待测探针及标准探针点到尼龙膜上，利用地高辛抗体-碱性磷酸酶(digoxigenin-alka li ne phosphatase，DIG-AP)系统呈色。比较待测与标准的色度，确定探针浓度，最后稀释成 10mg/L，分装、贮存于-80℃备用。此探针可用来进行原位杂交和Northern印迹杂交。
2.原位杂交
2.1 组织预处理：取大鼠上述组织以OCT包埋，快速液氮冷冻，在冰冻切片机上切取10 μm厚 的切片。以40g/L的多聚甲醛固定，室温下20min，磷酸盐缓冲液冲洗；加入10ml/L过氧化氢 20min以除去内源性过氧化物酶；以0.2mol/L HCI室温处理8min，除去内源性的碱性磷酸酶 ；以10mg/L的蛋白酶K室温消化10min，使组织穿透性增加；使用0.1mol/L三乙醇胺/无水乙 酸酐孵育10min，除去非特异性背景；最后用2×SSC冲洗。
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2.2 杂交反应及后处理：将探针稀释于杂交液中50mg/L，80℃加热5min，将探针加到载 玻片 上，每块组织50μl(根据组织大小)，将组织以盖玻片封好，放入湿盒杂交过夜约50～60℃( 根据探针的Tm值确定)。杂交后第2d以一定严格度进行洗脱。(一般用500ml/L甲酰胺)。1×S SC在50℃洗脱20min，2次。0.2×SSC在50℃洗脱20min。
2.3 免疫检测：以洗脱液冲洗5min，加入10g/L阻断液(NEN公司的ISH信号放大药盒)在3 7℃ 下封闭30min，在抗地高辛辣根过氧化物酶(digoxigenin-Horseradish peroxidase，DIG- H RP，1：50)中室温孵育1h后洗脱；重新加入阻断液和生物素-酪胺(biotin-tyramide)，置 于 暗处室温下10min后，洗脱液冲洗3次，每次5min；转入链球菌卵白素-碱性磷酸酶(strepta vidin-alkaline phosphatase，SP-AP)中室温下孵育1h后，洗脱液冲洗同上；再置于检测 液 内10min，在载玻片的组织上，加碱性磷酸酶反应底物(NBT，BCIP)，然后置于暗处湿盒中呈 色 。根据情况大约需10min至6h，加入TE缓冲液终止反应；使用Gelmount试剂(Fisher公司)封 片，观察结果。详细方法及试剂见文献[9，10]。
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3.Northern印迹杂交
体外转录合成味蛋白和转导蛋白基因的正义链，进行RNA琼酯糖凝胶电泳，转印到尼龙膜上 ，利用地高辛标记的转导蛋白基因的反义RNA链为探针，进行杂交。通过抗地高辛抗体与碱 性磷酸酶催化的化学发光反应在X线胶片上成像。
结 果
1.味蛋白及转导蛋白基因克隆
利用RT-PCR方法分别克隆得到1.37kb的大鼠α-味蛋白基因(包括全部编码序列)和1.03k b的大鼠α-rod转导蛋白基因。通过测序确定克隆的大鼠味蛋白基因与已知序列相同[ 6 ]，大鼠转导蛋白基因与小鼠的已知序列达99%相同[7]。分析表明，克隆的大鼠 味蛋白基因与转导蛋白基因有71%的同源性。
2.Northern印迹杂交
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由于味蛋白与转导蛋白有71%的同源性，为避免交叉反应，利用体外转录合成味蛋白和转导 蛋白正义链RNA，以DIG标记1.03kb长的转导蛋白反义链RNA为探针，在高严格度的条件下， 进行Northern印迹杂交，结果如图1所示。在电泳凝胶(图1a)上，可见转导蛋白(T)与味蛋白 (G)的RNA量基本相同。杂交后可见明显的转导蛋白RNA阳性杂交带，而没有味蛋白RNA与转导 蛋白探针的杂交带(图1b)。这证明在高严格度条件下有很高同源性的转导蛋白与味蛋白不产 生交叉杂交反应。因此，这种高严格度条件可用来进行原位杂交。
3.原位杂交
我们利用DIG标记1.37kb的α-味蛋白反义RNA链及1.03kb的α-rod转导蛋白反义RNA链 为试验探针，它们的正义链RNA为对照探针，进行大鼠视网膜及舌味蕾组织的原位杂交。为 提高原位杂交的敏感性，利用生物素-酪胺法使原位杂交信号放大。视网膜原位杂交结果如 图2显示，在视网膜的内节层和外核层即感光细胞所在部位有明显的α-rod转导蛋白的表达 (图2a)，但无论在视网膜的任何细胞均未见α-味蛋白的表达(图2b)。
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大鼠舌味蕾的原位杂交如图3显示，转导蛋白 mRNA在舌味蕾细胞中有一些表达(图3a)，而转 导蛋白mRNA的正义探针(阴性对照)无杂交反应(图3b)，但味蛋白mRNA在味蕾细胞中有很高的 表达(图3c，d)。本实验在成年大鼠轮廓乳头及叶状乳头的10μm冰冻切片上，共分析了150 个味蕾，平均每个味蕾有1.2个转导蛋白标记的阳性细胞，有6.2个味蛋白标记阳性细胞， 即在味蕾细胞中味蛋白表达的阳性细胞大约是转导蛋白表达阳性细胞的5倍。使用生物素- 酪 胺原位杂交信号放大法，可检测组织中低信息量的基因表达，这种信号的放大约为普通原位 杂交信号的5～10倍(图3c,d)。结果证明，味蛋白是舌上皮组织中味蕾细胞的特异性表达蛋 白，表达率约占味蕾细胞的4.1%，转导蛋白在味蕾细胞表达率约占0.8%。两种G-蛋白之 间无交叉杂交反应。
讨 论
本研究表明，转导蛋白及味蛋白都能表达于味蕾细胞中，但是表达味蛋白的细胞是表达转导 蛋白细胞的5倍。尽管转导蛋白与味蛋白有71%的同源性，但在高严格度条件下进行的杂交反 应显示这两种蛋白之间并无交叉反应。因此，尽管味蛋白和转导蛋白都可能与味感觉机制有 关，但它们之间在味觉感受功能中的作用可能是不同的。这两种蛋白在味蕾细胞中表达量的 差别可能反应了它们信号转导功能的不同。近期研究表明[11]，味蛋白敲除的小鼠 对苦味和甜味反应明显降低，而转导蛋白可以被苦味质激活；并且，膜受体与味蛋白的相互 作用可以被转导蛋白竞争性抑制。这表明味蛋白与转导蛋白在味觉信号转导过程中还可能具 有某种协同作用。
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在苦味和甜味信号转导的研究中，迄今未能在分子水平确认一种特异性的膜受体。据近期报 道显示，已克隆出某种哺乳动物味觉特异性受体[12]，这种受体只表达于味蕾细胞 而不表达于非感觉上皮，推论可能与苦味和甜味信号转导有关，但尚无证据。目前所知与味 觉有关的膜受体是代谢四型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptor4，mGluR4) [4，5]，该受体参与的只是谷氨酸味觉信号转导。现已知在味蕾中的mGluR4略不同于中 枢神经系统的mGluR4[13]，其N未端有300个氨基酸缺失。此种味觉的mGluR4能够结 合细胞外的谷氨酸，通过G蛋白调节细胞内cAMP的水平引发动作电位[14]，但对谷 氨酸的反应浓度与脑内的mGluR4完全不同，这可能是适应不同机能的需要，但目前尚不完全 清楚其信号转导本性。
生物素-酪胺原位杂交信号放大法的机理[15]，是通过辣根过氧化物酶催化生物素 - 酪胺沉淀在探针周围，较多的生物素-酪胺分子与链球菌卵白素-碱性磷酸酶结合，催化生 成 较多的紫蓝色信号，这种放大的信号为普通原位杂交的5～10倍。此方法可检测组织中低信 息量的基因表达，能够显示味蕾细胞中转导蛋白mRNA的真正水平。这就使本研究能够观察到 转导蛋白的确能在味蕾细胞中表达，而它与味蛋白在味感觉机制中存在着某种固定的相互关 系。对此有必要进行更深入的研究。
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图1 味蛋白和转导蛋白的Northern blot检测。a.100ng体外转录的味蛋白(G)或转 导蛋白(T )正义链RNA电泳图谱。b.以1.03kb DIG标记的反义链转导蛋白为探针，高严格度 Northern blot杂交的结果
图2 以味蛋白(G)和转导蛋白(T)反义链(as)为探针在大鼠视网膜的原位杂交。a. 在视网膜 感光细胞所在的内颗粒层(IS)和外核层(ONL)有很强的转导蛋白信号，而其他部分包括外颗 粒层(OS)、外丛层(OPL)、内核层(INL)都没有转导蛋白信号。b.味蛋白在视网膜没有任何 信号。
图3 在大鼠味蕾味蛋白和转导蛋白正义及反义链探针的原位杂交。a.以转导蛋白 反义链为探针在某些味蕾细胞中(↑)可见杂交信号。b.正义链探针则未见杂交信号；c.非酪 氨信号放大法的原位杂交强度较弱；d.味蛋白反义链探针的原位杂交信号很强
Fig.1 The Northern blot for transducin and gustducin.a. 100ng each of sense RNA from in vitro-transcr ibed gustducin (G) or transducin (T) was electrophoresed.b.The resulting Northern blot was hybri diz ed at high stringency with 1.03kb DIG labeled anti-sense probe for transduci n.
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Fig.2 ISH using transducin and gustducin anti-sense probes in rat retin a.a.T ransducin showed a strong signal in the photoreceptor cells of retina which is p re sented at the inner segment (IS) and outer nuclear layer (ONL) and absent from t he outer segment (OS),outer plexi form layer (OPL) and inner nuclear layer(INL). b.Gustducin did not show any signal in retina.
Fig.3 ISH with transducin and gustducin anti-sense and sense probes in rat tast e buds.a,Hybridization signal was showed in some taste bud cells (arrows) with t ransducin anti-sense probe.b,There was not in sections hybridized with sense pr obe.c,ISH without signal amplification showed less signal intensity than that o f tyramide signal amplification.d,There is very high ISH signal intensity using gustducin anti-sense probe.
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【基金项目】美国NIH/NIDCD基金资助项目(DC03013)
【作者简介】杨慧(1957-)，女(汉族)，吉林市人，硕士，副教授，副所长
参考文献
[1]Lindemenn B. Taste reception [J].Physiol Rev,199 6a,76(3):718-766.
[2]Bernhardt S J,Naim M. Zehavi U,et al. Changes in IP3 and cytosolic C a 2+ in response to sugars and nonsugar sweeteners in transduction of sweet tast e in the rat [J].J Physial,1996,490(2):325-336.
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[3]Cummings T A,Daniels C,Kinnamon S C. Sweet Taste transduction in ham ster. Sweeteners and cyclic nucleotides depolarize taste cells by reducing a K+ curr ent [J].J Neurophysiol,1996,75(3):1256-1263.
[4]Chaudhari N,Yang H,Lamp C,et al.The taste of monosodium glutamate:me mbrane receptors in taste buds [J].J Neurosci,1996,16(12):3817-3826.
[5]杨慧，徐群渊，Chaudhari N,等.用简并性引物 RT-PCR技术检测大鼠舌味 蕾细胞谷氨酸受体表达[J]，解剖学报，1997，28(4)：337～341.
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[6]Mclaughlin S K,Mckinnon P J,Margolskee R F.Gustducin is a taste-cel l-sp ecific G protein closely related to the transducins [J].Nature,1992,357(6379): 563-569.
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[8]Wong G T,Gannon K S,Margolskee R F.Transduction of bitter and sweet taste by gustducin [J].Nature,1996,381(6585):796-800.
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[9]Yang H,Wanner I B,Roper S D,et al.An optimized Method for in situ hy bridi zation with signal amplification that allows the detection of rare mRNA [J].J Histochem and Cytochem,1999,47(4):431-445.
[10]杨慧，蔡青，李淑婷，等.地高辛标记 RNA 探针原位杂交的简便方法[J ].解剖学报，1997，28(3)：333～336.
[11]Ming D,Ruiz-Avila L,Margolskee R F.Characterization and solubiliza tion of bitter-responsive receptors that couplet.Gustducin [J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,95(15):8933-8938.
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[13]Chaudhari N,Landin M A,Roper D S.A metabotropic glutamate receptor vari ant functions as taste receptor [J].Nature Neuroscience,2000.3(2):113-119.[ ZK)
[14]Lindemann B J. A taste for umami [J].Nature Neuroscience,2000,3(2 ):99-100.
[15]De Haas R R,Verwoerd P N,Van Der Corput P M,et al. The use of perox idase -mediated deposition of biotin-tyramide in combination with time-resolved fl uorescence imaging of europium chelate label in immunohistochemistry and in situ hybridzation [J].J Histochem Cytochem,1996,44(10):1091-1099.
【收稿日期】2000-07-28 【修回日期】2000-08-03, http://www.100md.com
单位：杨慧 徐群渊(首都医科大学，北京市神经科学研究所，北京100054)；杨慧 Roper S Chaudhari N(Department of Ph ysiology and Biophysics,University of Miami School of Medicine,Miami FL33101,USA)
关键词：味蛋白；转导蛋白；原位杂交；味觉
解剖学报00zk11
【摘要】目的 利用原位杂交检测味细胞中G蛋白的表达。 方法 分别用RT-PCR方法克隆大鼠味蛋白及(α-rod)转导蛋白的全长cDNA，制 备地高 辛标记的正义链及反义链探针。结果 原位杂交分析了150个大鼠味蕾 ， 结果显示味蛋白和转导蛋白在舌味蕾细胞中都有表达。但两种蛋白标记细胞数量有明显差别 。每个味蕾大约有1.2个转导蛋白阳性细胞，占总味蕾细胞的0.8%；而每个味蕾平均有6. 2个味蛋白阳性细胞，占总味蕾细胞的4.1%；即味蕾中味蛋白阳性细胞大约是转导蛋白阳性 细 胞的5倍。转导蛋白探针对味蛋白mRNA无交叉杂交反应。在视网膜上可见转导蛋白基因的高 度 表达，而无味蛋白的表达。结论 味蛋白和转导蛋白可能是味细胞的G -蛋白，但以味蛋白特异性表达为主，它们可能参与味觉的信号转导作用。
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【中图分类号】Q189 【文献标识码】A 【文章编号】0529-1356(2000)-增-41
IN SITU HYBRIDIZATION DETECTION OF GUSTDUCIN AND TRANSDUCIN EXPRESSION IN TASTE BUDS
YANG Hui，XU Qun-Yuan
(Beijing Institute for Neuroscience，Capital University of Medical S ciences，Beijing 100054， China；)
ROPER Stephen，CHAUDHARI Niru pa
(University of Miami School of Medicine，Miami FL33101，USA)
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【Abstract】Objective The in situ hybridiza tio n method was used with signal amplification system for detecting G-protein expr ession in taste buds.Methods The gene of gustducin and α-ro d tr ansducin in rat are cloned by RT-PCR.Their sense and antisense probes were labe l ed with digoxigenin.About 150 taste buds in rat vallate and foliate papillae wer e analyzed.Results The results showed that there were 1.2 tra n sducin-positive cells and 6.2 gustducin-positive cells counted in each taste b ud profile on average.The number of gustduin-positive cells was approximately fiv e times more than transducin-positive cells in taste buds.There were 4.1% gustd u cin-positive cells and 0.8% transducin-positive cells in all taste cells.It c ou ld not be seen any cross reation of transducin probe to gustducin target.The hi gh expression of transducin in retina was also observed but no gustducin express ion could be detected.Conclusion The result of present study p roved that both transducin and gustducin were taste G-protein and gustducin was high expressed.Both of them might be involved in taste signal transduction.
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【Key words】Gustducin;Transducin;in situ hyb ridization;Taste
一般认为，哺乳动物能感受5种基本味质，即甜、苦、酸、咸、鲜[1 ]。生理学研究 表明，不同味感受器对不同的味质选择性地产生反应[2，3]但反应模式不甚相同， 其中，酸和咸味质通过味感受器细胞膜上特异性的H+和Na+离子通道使细胞去极化；甜 、苦和鲜味质则通过GTP-结合蛋白和具有7个跨膜区的受体进行信号转导[4，5]。 已知味蛋白(gustducin)是一种味觉特异性G-蛋白[6]，专门表达于舌味蕾细胞而 不 表达于其他细胞。已有研究证明，味蛋白与主要参与视觉信号转导的转导蛋白(transducin) 有很高的同源性[7]，是两种相似的G-蛋白。因此，我们认为它们应该都能够选择 性地表达于味蕾细胞上，并可能是苦味、甜味和鲜味信号转导反应的重要成分[8] 。
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为进一步证实这一设想，我们利用高敏感度的原位杂交手段来检测味蛋白和转导蛋白在大鼠 舌味蕾的分布，希望能显示味细胞在表达上述两种G-蛋白数量上的差别，以便深入探讨它 们在味觉感受机制中的作用。
材料和方法
1.cDNA 克隆和RNA探针
选用大鼠舌的轮廓乳头和叶状乳头组织以及大鼠视网膜组织，提纯这些组织的mRNA(采用Inv itrogen公司的Fast Track药盒)，通过逆转录酶(GIBCO BRL 公司)合成cDNA。其中，根据大 鼠味蛋白序列83-232位氨基酸设计上游和下游PCR引物[6]，进行RT-PCR。将PC R产生的1.37kb的基因片段克隆进入PKS载体(Stratagene公司)。另外，按照小鼠α-rod转 导蛋白序列6-347位氨基酸设计PCR引物[7]，再克隆1.03kb的基因片段进入PKS载 体。将上述两种基因克隆进行DNA序列分析。
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上述两种基因的载体，经过线性化处理，在T7RNA聚合酶催化下，转录合成地高辛标记的 正 义链和反义链RNA探针(Roche公司的核酸标记检测试剂盒)。利用梯度倍比稀释法，将不同浓 度的待测探针及标准探针点到尼龙膜上，利用地高辛抗体-碱性磷酸酶(digoxigenin-alka li ne phosphatase，DIG-AP)系统呈色。比较待测与标准的色度，确定探针浓度，最后稀释成 10mg/L，分装、贮存于-80℃备用。此探针可用来进行原位杂交和Northern印迹杂交。
2.原位杂交
2.1 组织预处理：取大鼠上述组织以OCT包埋，快速液氮冷冻，在冰冻切片机上切取10 μm厚 的切片。以40g/L的多聚甲醛固定，室温下20min，磷酸盐缓冲液冲洗；加入10ml/L过氧化氢 20min以除去内源性过氧化物酶；以0.2mol/L HCI室温处理8min，除去内源性的碱性磷酸酶 ；以10mg/L的蛋白酶K室温消化10min，使组织穿透性增加；使用0.1mol/L三乙醇胺/无水乙 酸酐孵育10min，除去非特异性背景；最后用2×SSC冲洗。
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2.2 杂交反应及后处理：将探针稀释于杂交液中50mg/L，80℃加热5min，将探针加到载 玻片 上，每块组织50μl(根据组织大小)，将组织以盖玻片封好，放入湿盒杂交过夜约50～60℃( 根据探针的Tm值确定)。杂交后第2d以一定严格度进行洗脱。(一般用500ml/L甲酰胺)。1×S SC在50℃洗脱20min，2次。0.2×SSC在50℃洗脱20min。
2.3 免疫检测：以洗脱液冲洗5min，加入10g/L阻断液(NEN公司的ISH信号放大药盒)在3 7℃ 下封闭30min，在抗地高辛辣根过氧化物酶(digoxigenin-Horseradish peroxidase，DIG- H RP，1：50)中室温孵育1h后洗脱；重新加入阻断液和生物素-酪胺(biotin-tyramide)，置 于 暗处室温下10min后，洗脱液冲洗3次，每次5min；转入链球菌卵白素-碱性磷酸酶(strepta vidin-alkaline phosphatase，SP-AP)中室温下孵育1h后，洗脱液冲洗同上；再置于检测 液 内10min，在载玻片的组织上，加碱性磷酸酶反应底物(NBT，BCIP)，然后置于暗处湿盒中呈 色 。根据情况大约需10min至6h，加入TE缓冲液终止反应；使用Gelmount试剂(Fisher公司)封 片，观察结果。详细方法及试剂见文献[9，10]。
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3.Northern印迹杂交
体外转录合成味蛋白和转导蛋白基因的正义链，进行RNA琼酯糖凝胶电泳，转印到尼龙膜上 ，利用地高辛标记的转导蛋白基因的反义RNA链为探针，进行杂交。通过抗地高辛抗体与碱 性磷酸酶催化的化学发光反应在X线胶片上成像。
结 果
1.味蛋白及转导蛋白基因克隆
利用RT-PCR方法分别克隆得到1.37kb的大鼠α-味蛋白基因(包括全部编码序列)和1.03k b的大鼠α-rod转导蛋白基因。通过测序确定克隆的大鼠味蛋白基因与已知序列相同[ 6 ]，大鼠转导蛋白基因与小鼠的已知序列达99%相同[7]。分析表明，克隆的大鼠 味蛋白基因与转导蛋白基因有71%的同源性。
2.Northern印迹杂交
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由于味蛋白与转导蛋白有71%的同源性，为避免交叉反应，利用体外转录合成味蛋白和转导 蛋白正义链RNA，以DIG标记1.03kb长的转导蛋白反义链RNA为探针，在高严格度的条件下， 进行Northern印迹杂交，结果如图1所示。在电泳凝胶(图1a)上，可见转导蛋白(T)与味蛋白 (G)的RNA量基本相同。杂交后可见明显的转导蛋白RNA阳性杂交带，而没有味蛋白RNA与转导 蛋白探针的杂交带(图1b)。这证明在高严格度条件下有很高同源性的转导蛋白与味蛋白不产 生交叉杂交反应。因此，这种高严格度条件可用来进行原位杂交。
3.原位杂交
我们利用DIG标记1.37kb的α-味蛋白反义RNA链及1.03kb的α-rod转导蛋白反义RNA链 为试验探针，它们的正义链RNA为对照探针，进行大鼠视网膜及舌味蕾组织的原位杂交。为 提高原位杂交的敏感性，利用生物素-酪胺法使原位杂交信号放大。视网膜原位杂交结果如 图2显示，在视网膜的内节层和外核层即感光细胞所在部位有明显的α-rod转导蛋白的表达 (图2a)，但无论在视网膜的任何细胞均未见α-味蛋白的表达(图2b)。
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大鼠舌味蕾的原位杂交如图3显示，转导蛋白 mRNA在舌味蕾细胞中有一些表达(图3a)，而转 导蛋白mRNA的正义探针(阴性对照)无杂交反应(图3b)，但味蛋白mRNA在味蕾细胞中有很高的 表达(图3c，d)。本实验在成年大鼠轮廓乳头及叶状乳头的10μm冰冻切片上，共分析了150 个味蕾，平均每个味蕾有1.2个转导蛋白标记的阳性细胞，有6.2个味蛋白标记阳性细胞， 即在味蕾细胞中味蛋白表达的阳性细胞大约是转导蛋白表达阳性细胞的5倍。使用生物素- 酪 胺原位杂交信号放大法，可检测组织中低信息量的基因表达，这种信号的放大约为普通原位 杂交信号的5～10倍(图3c,d)。结果证明，味蛋白是舌上皮组织中味蕾细胞的特异性表达蛋 白，表达率约占味蕾细胞的4.1%，转导蛋白在味蕾细胞表达率约占0.8%。两种G-蛋白之 间无交叉杂交反应。
讨 论
本研究表明，转导蛋白及味蛋白都能表达于味蕾细胞中，但是表达味蛋白的细胞是表达转导 蛋白细胞的5倍。尽管转导蛋白与味蛋白有71%的同源性，但在高严格度条件下进行的杂交反 应显示这两种蛋白之间并无交叉反应。因此，尽管味蛋白和转导蛋白都可能与味感觉机制有 关，但它们之间在味觉感受功能中的作用可能是不同的。这两种蛋白在味蕾细胞中表达量的 差别可能反应了它们信号转导功能的不同。近期研究表明[11]，味蛋白敲除的小鼠 对苦味和甜味反应明显降低，而转导蛋白可以被苦味质激活；并且，膜受体与味蛋白的相互 作用可以被转导蛋白竞争性抑制。这表明味蛋白与转导蛋白在味觉信号转导过程中还可能具 有某种协同作用。
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在苦味和甜味信号转导的研究中，迄今未能在分子水平确认一种特异性的膜受体。据近期报 道显示，已克隆出某种哺乳动物味觉特异性受体[12]，这种受体只表达于味蕾细胞 而不表达于非感觉上皮，推论可能与苦味和甜味信号转导有关，但尚无证据。目前所知与味 觉有关的膜受体是代谢四型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptor4，mGluR4) [4，5]，该受体参与的只是谷氨酸味觉信号转导。现已知在味蕾中的mGluR4略不同于中 枢神经系统的mGluR4[13]，其N未端有300个氨基酸缺失。此种味觉的mGluR4能够结 合细胞外的谷氨酸，通过G蛋白调节细胞内cAMP的水平引发动作电位[14]，但对谷 氨酸的反应浓度与脑内的mGluR4完全不同，这可能是适应不同机能的需要，但目前尚不完全 清楚其信号转导本性。
生物素-酪胺原位杂交信号放大法的机理[15]，是通过辣根过氧化物酶催化生物素 - 酪胺沉淀在探针周围，较多的生物素-酪胺分子与链球菌卵白素-碱性磷酸酶结合，催化生 成 较多的紫蓝色信号，这种放大的信号为普通原位杂交的5～10倍。此方法可检测组织中低信 息量的基因表达，能够显示味蕾细胞中转导蛋白mRNA的真正水平。这就使本研究能够观察到 转导蛋白的确能在味蕾细胞中表达，而它与味蛋白在味感觉机制中存在着某种固定的相互关 系。对此有必要进行更深入的研究。
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图1 味蛋白和转导蛋白的Northern blot检测。a.100ng体外转录的味蛋白(G)或转 导蛋白(T )正义链RNA电泳图谱。b.以1.03kb DIG标记的反义链转导蛋白为探针，高严格度 Northern blot杂交的结果
图2 以味蛋白(G)和转导蛋白(T)反义链(as)为探针在大鼠视网膜的原位杂交。a. 在视网膜 感光细胞所在的内颗粒层(IS)和外核层(ONL)有很强的转导蛋白信号，而其他部分包括外颗 粒层(OS)、外丛层(OPL)、内核层(INL)都没有转导蛋白信号。b.味蛋白在视网膜没有任何 信号。
图3 在大鼠味蕾味蛋白和转导蛋白正义及反义链探针的原位杂交。a.以转导蛋白 反义链为探针在某些味蕾细胞中(↑)可见杂交信号。b.正义链探针则未见杂交信号；c.非酪 氨信号放大法的原位杂交强度较弱；d.味蛋白反义链探针的原位杂交信号很强
Fig.1 The Northern blot for transducin and gustducin.a. 100ng each of sense RNA from in vitro-transcr ibed gustducin (G) or transducin (T) was electrophoresed.b.The resulting Northern blot was hybri diz ed at high stringency with 1.03kb DIG labeled anti-sense probe for transduci n.
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Fig.2 ISH using transducin and gustducin anti-sense probes in rat retin a.a.T ransducin showed a strong signal in the photoreceptor cells of retina which is p re sented at the inner segment (IS) and outer nuclear layer (ONL) and absent from t he outer segment (OS),outer plexi form layer (OPL) and inner nuclear layer(INL). b.Gustducin did not show any signal in retina.
Fig.3 ISH with transducin and gustducin anti-sense and sense probes in rat tast e buds.a,Hybridization signal was showed in some taste bud cells (arrows) with t ransducin anti-sense probe.b,There was not in sections hybridized with sense pr obe.c,ISH without signal amplification showed less signal intensity than that o f tyramide signal amplification.d,There is very high ISH signal intensity using gustducin anti-sense probe.
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【基金项目】美国NIH/NIDCD基金资助项目(DC03013)
【作者简介】杨慧(1957-)，女(汉族)，吉林市人，硕士，副教授，副所长
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【收稿日期】2000-07-28 【修回日期】2000-08-03, http://www.100md.com