王和庚 黎洪棉 田举 赵培冉 梁双武

    皮肤慢性溃疡在临床上极为常见。老年患者一般情况差，基础疾病多，细胞增殖和再生受限，创面修复和治疗较为棘手。组织工程化人工皮肤的构建和应用为临床大面积皮肤缺损的修复治疗提供了新的途径和方法。骨髓间充质干细胞(BMSC)是一种具有多项分化潜能的细胞，来源丰富，分离培养容易，已成为组织工程研究中常用的种子细胞[1-4]。近年的研究表明其对心、肺、皮肤、肌肉等组织创伤具有促进愈合和功能修复的作用[5-6]。富血小板血浆(PRP)是通过离心分离自体全血而得到的血小板浓缩物，经激活后能释放出大量高浓度的生长因子，刺激细胞增殖分化并促进软组织的修复[6]。本研究在前期对间充质干细胞体外分离培养与细胞标记等研究基础上，体外培养异体BMSC，并与自体PRP联合应用于皮肤慢性溃疡的治疗，以观察两者是否有协同作用[7]。

    材料与方法

    一、材料和试剂

    1.实验动物

    健康成年SD大鼠17只，6～8周龄，体质量约150 g，雌雄不限，由南方医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

    2.主要试剂及仪器

    包括DMEM、胎牛血清(美国Gibco)，地塞米松、胰岛素、吲哚美辛、胰蛋白酶、茜素红、油红O、DiI、二甲亚砜、异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)、转化生长因子(TGF)-β1、阿尔辛蓝、羊抗兔IgG-FITC、羊抗鼠IgG-cy3(美国Sigma)，CO2恒温培养箱(德国HERABUS)，兔抗鼠CD29、CD44抗体(武汉博士德)，外科用冻干人纤维蛋白原及溶解液、外科用冻干人凝血酶(华兰生物)。

    二、方 法

    1.BMSC的分离、培养、传代与鉴定

    取1只SD大鼠，行颈椎脱位法处死，于无菌条件下取出双侧股骨，去除股骨双侧干骺端，用DMEM高糖完全培养基冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞，以Ficoll液低速离心5 min，收集并计数有核细胞，加入等量含体积分数为10%胎牛血清的DMEM，稀释后接种于75 ml培养瓶，置于5%CO2、饱和湿度、37℃恒温培养箱中进行细胞培养，5 d后半量换液，以后每3 d换液1次，待细胞长至80%融合后消化传代，以此获得大鼠BMSC，采用第3代细胞进行实验。BMSC生长至培养瓶底70%～80%面积时，改用向脂肪细胞分化的诱导培养基(含10%胎牛血清，1μmmol/L地塞米松，10μmol/L胰岛素，200μmol/L吲哚美辛 ......