何苏苏 冯加喜 林云 林玲 王良兴

    肺血管重构在慢性低氧性肺动脉高压(HPH)的发生、发展中至关重要，但其发病机制至今仍未完全阐明。巢蛋白(nestin)属于第六类中间丝蛋白，主要出现在未分化具有分裂能力的细胞中，在分化成熟后，巢蛋白表达下调，在组织损伤再生过程中又呈现返祖性表达[1]。本研究观察在不同低氧间期大鼠肺组织及肺血管平滑肌细胞(PASMC)巢蛋白的含量及其表达变化，旨在探讨巢蛋白在HPH形成中的意义，现报告如下。

    材料与方法

    一、实验动物及分组

    二级健康雄性SD大鼠30只，体质量180～220 g，由温州医学院动物中心提供。按随机排列法随机分成正常对照组 (N 组)、低氧2周(H2w)组、低氧4周组(H4w)，每组各10只。

    二、主要仪器和试剂

    主要仪器包括常压低氧舱(长沙华曦电子科技有限公司)，SJ-42型生理记录仪，YL-3，4型压力传感器，细胞超净工作台 (苏净集团安泰公司)，低氧(CO2/N2)培养箱(Heraeus，德国)，三目倒置生物显微镜 (Nikon，日本)，PCR仪(杭州博日科技有限公司)，PCR电泳仪(北京市六一厂)，凝胶成像系统(温州市奥利生物医学仪器厂)，蛋白电泳系统(Bio-Rad，美国)。

    主要试剂包括巢蛋白单克隆抗体(BD Pharmingen，美国)，山羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥)，β-actin(Santa Cruz，美国)，DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco，美国)，胶原酶I(Sigma，美国)，Trizol总RNA抽提试剂(Invitrogen，美国)，PCR 试剂盒 (Fermentas，美国)，RIPA裂解液、显影剂、定影剂(上海碧云天生物技术研究所)。

    三、方 法

    1.低氧动物模型制备

    正常对照组大鼠于常压、常氧条件下舱外饲养；H2w组、H4w组置于常压、低氧饲养舱内，O2浓度维持在9.0% ～11.0%，CO2浓度维持在5.5% ～6.5%，每日8 h，每周6 d，分别饲养2周、4周，舱内用无水CaC12吸收水蒸气，碱石灰吸收多余的CO2。

    2.肺动脉平滑肌原代细胞培养、传代及分组

    在细胞超净工作台操作：取SD大鼠，腹腔麻醉后取出心肺组织，用显微镊分离肺动脉，去除外膜和内膜，将中膜平滑肌用0.2%胶原酶Ⅰ消化，接种于含20%胎牛血清的DMEM的25 ml培养瓶，3 d后换液，约1周后细胞已基本呈融合生长，再进行传代 ......