黄桢钧 刘慰华 钟赟 刘少军

    基础研究论著

    饥饿诱导人胚肾细胞自噬模型的构建

    黄桢钧 刘慰华 钟赟 刘少军

    目的探讨饥饿诱导的人胚肾细胞(HEK293)自噬模型的构建。方法采用Earle's平衡盐溶液(EBSS)分别处理HEK293细胞0、1、2、4、8 h，显微镜下观察细胞形态变化，蛋白免疫印迹法检测自噬微管相关蛋白轻链(LC)3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62的表达；双荧光mRFP-eGFP-LC3(ptfLC3)质粒转染HEK293细胞24 h后，荧光显微镜观察EBSS饥饿条件下细胞内红色和绿色LC3荧光亮点的变化。结果饥饿处理后，HEK293细胞皱缩、变小变圆，蛋白免疫印迹法可检测到LC3的蛋白表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加；荧光显微镜可观察到细胞内红色和绿色LC3荧光亮点均增加。结论饥饿可成功诱导HEK293细胞自噬，表现为LC3蛋白表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的增加，以及荧光显微镜下细胞内红色和绿色LC3荧光亮点的增加。

    饥饿；自噬；自噬微管相关蛋白轻链3；p62；双荧光检测

    自噬是细胞内的一种蛋白降解途径，即细胞中受损的蛋白质、细胞器被双层膜结构包绕形成自噬体，与溶酶体结合后即可被降解[1]。自噬普遍存在于真核细胞内，无论是在生理过程还是在病理状态下，均可见自噬现象。研究表明，自噬参与了神经退行性疾病、心脏疾病和恶性肿瘤等多种疾病的发生、发展[2-3]。当细胞缺乏营养即饥饿时可激活自噬，饥饿性自噬是最基本的自噬过程。本研究选用常用的工具细胞——人胚肾细胞(HEK293细胞)，以Earle's平衡盐溶液(EBSS)处理作为饥饿手段，建立HEK293细胞自噬模型，旨在为自噬的研究提供更具有普遍意义的方法学参考[4]。

    材料与方法

    一、细胞来源

    HEK293细胞购自中国科学院细胞库，采用含10%胎牛血清、1%链-青霉素的DMEM培养液，在37℃、5%CO2饱和湿度下培养，0.25%胰酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

    二、主要试剂

    DMEM培养液、EBSS购自美国Gibco公司，雷帕霉素购自上海生工生物工程股份有限公司，mRFP-eGFP-自噬微管相关蛋白轻链(LC)3质粒购自美国Addgene公司。LC3B兔抗人多克隆抗体购自美国Sigma公司，p62兔抗人多克隆抗体购自美国Cell Signaling公司，内参照物GAPDH鼠抗人单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔、羊抗小鼠IgG购自美国Cell Signaling公司 ......