作者单位：524001 湛江，广东医学院附属医院神经病学研究所 广东省衰老相关心脑血管疾病重点实验室(李文，赵斌，冯杜)；524001 湛江,广东医学院附属医院麻醉科(胡喆，杨玥)，神经内科(林智君，陈煜森，钟望涛，林春霞)

    miR-137对Parkin诱导的线粒体自噬的影响

    李文胡喆林智君杨玥陈煜森钟望涛林春霞赵斌冯杜

    【摘要】目的探讨miR-137对Parkin诱导的线粒体自噬的影响。方法将miR-137 mimics和miR-137 inhibitor分别转染进HeLa细胞8 h后，再转染pEGEPC1-Parkin，24 h之后加羰基-氰-对-三氟甲氧基本腙(FCCP)处理4 h或者不加FCCP，利用免疫荧光和蛋白免疫印迹技术分析 miR-137对线粒体自噬的影响。用实时定量PCR方法检测帕金森病患者与健康对照者血液样本中miRNAs的表达情况。结果在FCCP作用下，Parkin的表达促进细胞自噬分子LC3由LC3Ⅰ型变为LC3Ⅱ型，Parkin蛋白从胞浆转位至线粒体。而细胞先经外源过表达miR-137处理之后，Parkin引起的细胞自噬受到显著抑制(P=0.003)。miR-137在帕金森病患者血液中的表达水平显著高于健康对照组(P0.05。健康对照者否认有家族性及遗传性帕金森病。本研究经广东医学院附属医院医学伦理委员会批准，受试者均知情同意。

    二、主要试剂

    HeLa细胞为本实验室保存细胞株，培养基和血清均购自Hyclone公司，胰酶、细胞消化液、双抗、抗荧光淬灭液购自碧云天公司。Trizol(Life Technology，15596-026)，DNA酶I(包含10×反应缓冲液和氯化镁)，pEGFPC1-Parkin由本实验室构建。线粒体内膜易位酶(TIM23)抗体 (BD Biosciences，611222)，线粒体外膜受体(TOM20)抗体 (BD Biosciences，612278)，LC3B 多克隆抗体 (Sigma，L7543)，电压依赖性电离子通道(VDAC1) 单克隆抗体 (Abcam，ab14734)，Tubulin 单克隆抗体 (Earthox，E021040)，绿色荧光蛋白抗体(Santa Cruz，sc-9996)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 (Earthox，E030110)和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G (Earthox，E030120) 用于蛋白免疫印迹检测。Alexa fluor 555 标记的驴抗小鼠免疫球蛋白G(Life Technologies ......