高蕾 郁兰芳

    314300 嘉兴，浙江省海盐县人民医院妇产科(高蕾)；310003杭州，浙江大学医学院第一附属医院肿瘤内科(郁兰芳)

    瞬时受体电位C1对人卵巢癌细胞ES-2增殖和凋亡的影响

    高蕾郁兰芳

    314300 嘉兴，浙江省海盐县人民医院妇产科(高蕾)；310003杭州，浙江大学医学院第一附属医院肿瘤内科(郁兰芳)

    【摘要】目的探讨瞬时受体电位C1(TRPC1)对人卵巢癌细胞ES-2增殖和凋亡的影响。方法利用荧光定量PCR检测人卵巢癌细胞ES-2、SKOV3、OV1以及OV2和正常卵巢上皮细胞IOSE80中TRPC1的表达水平。设计并合成靶向TRPC1的特异性短发卡RNA(shRNA)，通过脂质体转染TRPC1表达最高的人卵巢癌细胞ES-2以构建稳定低表达TRPC1细胞株ES-2/shRNA，通过蛋白免疫印迹法和荧光定量PCR检测shRNA的干扰效率、MTT比色法检测干扰后细胞的增殖能力、流式细胞仪检测细胞凋亡情况、蛋白免疫印迹法检测磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、细胞周期素D1(Cyclin D1)以及B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的表达水平。结果在4种卵巢癌细胞株中，ES-2 的TRPC1表达水平最高。特异性靶向转染TRPC1 shRNA能够有效下调ES-2细胞中TRPC1表达水平；ES-2/shRNA细胞的增殖速度较转染空白载体的ES-2/Con及ES-2细胞明显减慢(P一、细胞培养

    人卵巢癌细胞株ES-2、SKOV3、OV1以及OV2与正常卵巢上皮细胞株IOSE80购自中国科学院上海细胞库。5株细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培基中，并置于5%CO2以及37℃培养箱内培养。倒置显微镜下观察细胞生长情况，待细胞长至约80%用含依地酸二钠(EDTA)的胰酶消化并传代培养。取对数生长期的细胞进行实验。

    二、TRPC1的特异性shRNA转染

    TRPC1 shRNA购自美国Santa Cruz公司(Cat. sc-270467-SH)。采用脂质体转染技术，具体操作流程参照英韦创津公司的Lipofectamine2000产品说明书。转染48 h后加入筛选抗生素G418，浓度为400 μg/ml，维持培养6 d后，G418浓度改为200 μg/ml；细胞扩增后，提取蛋白和RNA，进行荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法鉴定。

    三、TRPC1 mRNA表达水平的检测

    采用荧光定量PCR法检测。稳定转染后，用Trizol提取总RNA ......