刘越峰 罗卫民 张勇 钟晓东

    ·基础研究论著·

    miRNA-200b通过靶向VEGF抑制视网膜母细胞瘤细胞生长与侵袭

    刘越峰罗卫民张勇钟晓东

    目的明确miRNA-200b是否通过调控靶向血管内皮生长因子(VEGF)的表达而抑制视网膜母细胞瘤细胞的生长与侵袭，进一步揭示miRNA-200b抗肿瘤的分子机制。方法将视网膜母细胞瘤Y79细胞分成6组：miRNA-200b、miRNA-NC、sh-VEGF、shRNA-NC、miRNA-200b+sh-VEGF、miRNA-NC+shRNA-NC组。荧光素酶报告系统检测miR-200b对VEGF的3’-非翻译区荧光素酶活性的影响；蛋白免疫印迹法检测sh-VEGF转染的干扰效果；MTS实验与Transwell侵袭实验分别检测上述各组对视网膜母细胞瘤细胞增殖与侵袭的影响。结果荧光素酶报告检测结果显示，miR-200b能特异性地与VEGF的3’-非翻译区结合，并抑制其荧光素酶的活性；蛋白免疫印迹法显示，sh-VEGF转染组中VEGF的蛋白表达水平较对照组明显下调；MTS实验结果显示，转染miRNA-200b 组与sh-VEGF组48 h后视网膜母细胞瘤细胞的生存率均低于各自对照组(P均材料与方法

    一、主要材料

    miRNA-200b 模拟物(miRNA-200b)及无关序列对照(miRNA-NC)从美国Ambion公司购买，miRNA-200b 模拟物序列为，5’-TCATCATTACCAGGCAGTATTA-3’，miRNA-NC序列为 5’-AATGGAACGATACAGAGTAGATT-3’， VEGF Short Hairpin RNA(shRNA) Lentiviral Particles (Human, sc-108080)重组载体pRFP-C-RS(VEGF shRNA)及其对照为shRNA-NC，鼠单抗人VEGF和鼠单抗GAPDH购买于美国Santa cruz公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗购买于武汉博士德公司。pcDNA 3.1-VEGF重组载体(A DNA sequence encoding the mature form of human VEGF)、VEGF、pcDNA3.1空载体对照(vector)、突变型VEGF的3’-非翻译区(3’-untranslated region，3’-UTR)的荧光素酶报告载体(VEGF-mut)和野生型VEGF的3’-UTR的荧光素酶报告载体(VEGF-wt)由广州市复能基因公司成功构建 ......