孟凡航?陈秋源?顾世杰?崔瑞文?曹荣华

    【摘要】目的 研究分泌型Klotho蛋白抑制腎间质纤维化的机制，为治疗慢性肾脏病提供理论基础和新思路。方法 通过单侧输尿管梗阻(UUO)诱导C57BL/6小鼠肾纤维化，并分5组处理：假手术[Sham+磷酸盐缓冲液(PBS)]组、模型(UUO+PBS)组、UUO+Klotho组、UUO+Klotho+胰岛素组、UUO+Klotho+胰岛素样生长因子-1(IGF-1)组。检测小鼠左肾组织活性氧水平，并用HE及Masson染色评估肾脏病理改变及纤维化程度。实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹法以及免疫荧光化学检测肾组织中超氧化物歧化酶2 (SOD2)、纤连蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平，此外用蛋白免疫印迹法检测磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、AKT、磷酸化磷脂酰肌醇(-3)激酶(p-PI3K)、PI3K、胰岛素受体底物-1(IRS-1)蛋白表达水平。结果 成功建立了UUO小鼠模型。与UUO+PBS组比较，UUO+Klotho组小鼠肾组织的纤维化缓解(P 90%)和重组小鼠IGF-1蛋白(纯度 > 97%)，购自美国R&D公司;胰岛素，购自江苏万邦生化医药集团有限责任公司。组织活性氧(ROS)检测试剂盒购自百奥莱博公司;HE染色试剂盒购自武汉谷歌生物科技有限公司;Masson染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;抗体蛋白激酶B(AKT)、磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3K)、胰岛素受体底物-1(IRS-1)、磷酸化AKT(p-AKT)均购自美国CST公司;α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体购自博士德生物工程有限公司;纤连蛋白(Fibronectin)抗体购自美国Sigma公司;p-PI3K抗体购自美国Bioworld公司;超氧化物歧化酶2(SOD2)抗体购自美国Abcam公司;GAPDH抗体购自美国Proteintech公司;RNA提取试剂Trizol购自荷兰MRC公司; M-MLV Reverse Transcriptase逆转录试剂盒购自美国Promega公司;高灵敏性染料法荧光实时定量PCR(qRT-PCR) 检测试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;RIPA裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒、BeyoECL Plus (超敏ECL化学发光试剂盒)、DAPI均购自上海碧云天生物技术有限公司;蛋白免疫印迹法二抗辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG (H+L)及辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗小鼠(H+L)均购自美国Jackson公司;免疫荧光二抗Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG(H+L)购自美国Invitrogen公司 ......