针灸"足三里""关元"穴对阳虚大鼠免疫功能影响的比较研究
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(湖北中医学院针灸骨伤系,武汉430061)
摘 要 采用针刺、艾灸、针加灸不同的治疗方法,选用"足三里"、"关元"两个强壮穴位,选择介导机体免疫的T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞为指标,以实验性"阳虚"大鼠为受试对象,对不同针灸疗法、不同穴位进行比较研究。结果表明:针灸可调节机体低下的免疫功能,且针加灸的作用优于单纯的针或灸的治疗;"足三里"穴的作用优于"关元"穴。
主题词 阳虚/针灸疗法 阳虚/免疫学 免疫系统/针灸效应 穴,足三里 穴,关元
本项研究从"证"这一中医整体思维出发,选择具有"免疫监视"性的免疫指标(T淋巴细胞亚群、体外抗体形成细胞)作为观察指标,进行针刺、艾灸、针加灸不同治疗方法及"足三里""关元"两个强壮穴位的比较研究。现报道如下。
1 材料和方法
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1.1 实验动物Wister大鼠80只,6～7周龄,200～250 g,雌雄兼用。同济医科大学动物部提供。
1.2 主要药品、试剂及工作液醋酸氢化泼尼松悬液(AHP):原液125 mg/5 ml,(江苏制药厂产品);APAAP法免疫组化试剂盒(T-Subset-Rit)、淋巴细胞分层液(Ficoll-Urographin)(北京邦定泰克生物技术有限公司提供);5%和15%新鲜绵羊红血球(SEBC)(同济医大免疫学教研室提供);豚鼠新鲜血清-补体、1%肝素、pH 7.2 Hanks液、磷酸盐缓冲液等自行配制。
1.3 主要仪器设备Olympus生物显微镜,国营华东电子管厂产酶标仪,北京产水平离心机,Sony恒温培养箱,低温电冰箱等。
1.4 实验方法
1.4.1 "阳虚"大鼠动物模型的建立[1] Wistar大鼠每日每鼠大腿肌肉注射AHP 3 mg/100 g体重,连续5天。大鼠出现拱背、蜷曲、肢尾冷、挤卧在一起、神疲,反应迟钝、被毛疏松、失去光泽、消瘦、少食等腰膝酸软(游泳存活时间缩短)畏寒肢冷、精神不振、脱毛虚损状。根据中医阳虚证辨证参考标准[2],类似"阳虚"状态。
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1.4.2 分组 未造模前从80只大鼠中,随机抽取10只作为正常生理组(A组)。余70只造模成功后,随机分为7个组,每组10只。分别为:模型对照组(B组),针刺"关元"组(C组)、艾灸"关元"组(D组)、针刺"足三里"组(E组)、艾灸"足三里"组(F组)、针灸"关元"组(G组)、针灸"足三里"组(H组)。
1.4.3 观察指标及检测方法 T淋巴细胞亚群:APAAP法即碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联免疫酶染色法[3]。此法目前已广泛应用于淋巴细胞分化抗原的分析研究。其特点是将第一抗体--小鼠抗大鼠T亚群单克隆抗体与待测抗原结合,以第二抗体--羊抗鼠IgG二抗起桥抗体作用,即其中一个Fab段连接第一抗体,另一个Fab段连接APAAP复合物,再通过复合物中的碱性磷酸酶催化其底物显色来显示抗原的存在。其法的关键是外周血单个核细胞(PBMC)的分离:采血前大鼠空腹12 h后摘眼球采血。取肝素0.2 ml抗凝血2 ml,用PBS稀释3倍,加入到含有3 ml淋巴细胞分离液的试管上层,血液沿管壁缓缓加入,使两液间保持清晰界面。离心(2000 r/min)15 min。吸取血浆和分离液之间的单个核细胞层,加5倍PBS混匀,离心(1000 r/min)5 min,去掉上清沉淀即为单个核细胞。体外抗体形成细胞[3]:QHS法即定量溶血分光光度测定法。此法是根据溶血空斑试验的原理衍化而来,可用以测定由一定数量的B细胞产生和分泌的抗体裂解红细胞后释放的血红蛋白(以OD值表示),以反应机体体液免疫功能。其法的关键是免疫大鼠及脾细胞悬液的制备:用5%SRBC 2 ml注射大鼠腹腔,4天后拉脱大鼠颈椎处死,取出脾脏放在已加入8 ml左右Hanks液的平皿中,用100目的不锈网研磨后,经尼龙布过滤后放入试管中,离心(1000 r/min)10 min洗2次。将沉淀的脾细胞重悬于Hanks液中细胞计数后配成1×107 /ml细胞浓度。
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1.4.4 治疗方法 参照华兴邦等的动物腧穴标准定位法[4],选择"足三里"穴(左右交替使用)和"关元"穴。C、E二组采用28号1.5寸毫针常规进针,进针后平补平泻,每5 min行针1次,留针15 min;D、F二组采用自制的直径0.8 cm,长5 cm艾灸于穴位上施温和灸,灸15 min;G、H二组针刺同时艾灸(操作同前),持续15 min。含有艾灸的治疗组在穴处剪净毛,治疗时以大鼠相对安静为度。治疗于每日8∶30～11∶30、14∶30～16∶30进行,每日行1次,共14次为一个疗程。
1.4.5 实验数据的统计与处理 所有计量资料结果用均数±标准差(x±s)表示,统计学用t、F、q检验。
2 实验结果
2.1 造模前后大鼠免疫功能比较见表1。
从表1中实验数据显示,根据成组资料均数比较t检验求得tCD3(10)=9.92,tCD4(10)=8.73,tCD8(10)=7.61,t0.01(10)=3.17,P表2实验数据显示:各治疗组与模型组比较CD3、CD4、CD8、QHS水平增高,经t检验其差异有显著或非常显著性意义(PCD3=250.65、FCD4=211.35、FCD8=183.21,以r(组间)=7,r(组内)=72查方差分析F界值表,得P3、CD4、CD8有差别。进一步作q检验后C组与D组、E组与F组、G组与H组各指标间差异无显著性意义(P>0.05);G组、H组与C、D、E、F组分别两两比较,CD3、CD4、CD8间差异有非常显著性意义(P
从表3实验数据显示:含"足三里"穴组与含"关元"穴组比较,根据成对资料均数的t检验:tCD3=2.167 tCD4=2.205 tCD8=2.063而查t界值表t0.05(29)=2.045,t0.01(29)=2.462。故P, http://www.100md.com(陈雄华 刘又香等)