苦参碱抗人鼻咽癌CNE2细胞的作用及其机制研究(1)
 |
 |
摘要 目的：观察苦参碱对人鼻咽癌CNE2细胞的作用，并探讨其作用机制。方法：倒置相差显微镜观察苦参碱对人鼻咽癌CNE2细胞形态的影响；CCK-8法检测苦参碱对CNE2细胞增殖的影响；流式细胞仪分析苦参碱对CNE2细胞周期的影响；Annexin V-FITC/PI法检测苦参碱对CNE2细胞凋亡影响。结果：苦参碱处理后CNE2细胞形态发生改变：细胞皱缩，变小变圆，空泡明显。苦参碱对CNE2细胞具有明显的抑制作用，并呈量效和时效关系。与对照组相比,苦参碱处理后的CNE2细胞G0/G1期比例明显增高，S期、G2/M期比例下降。苦参碱能诱导CNE2细胞的凋亡，其发生率随着药物浓度的增加而增加。结论：苦参碱能抑制人鼻咽癌CNE2细胞的增殖，它通过阻滞细胞周期和诱导凋亡来抑制CNE2的增殖。
关键词 苦参碱 人鼻咽癌CNE2细胞 增殖 周期 凋亡 实验研究
鼻咽癌是我国南方及东南亚地区高发的恶性头颈部肿瘤，放射治疗是其主要的治疗方法，但由于放疗对靶细胞杀伤缺乏选择性及在疗效和毒副作用方面的剂量依赖性，鼻咽癌患者的5年生存率维持在50%左右[1]。需要寻找新的治疗药物与方法以提高鼻咽癌的治疗效果。
, 百拇医药
苦参碱(MT)是中药苦参的主要有效成分,属于四环的喹诺里西啶类(quinolizidine),分子式为C15H24N2,具有抗病原体、抗炎症、抗肿瘤、抗心律失常等生物活性[2]。据动物实验研究及临床报道,其对多种肿瘤有防治作用,如消化道的肝癌、胃癌,神经系统的神经母细胞瘤、脑胶质瘤以及卵巢癌、白血病等[3]。本实验观察苦参碱对人鼻咽癌CNE2增殖、细胞周期和凋亡方面的影响，探讨其对鼻咽癌可能的作用机制，以便为临床治疗鼻咽癌提供新的思路。
1 材料
1.1 细胞和试剂：人鼻咽癌细胞株CNE2购自湖南湘雅细胞中心,苦参碱购自西安市天园生物制剂厂,细胞培养基RPMI-1640购自GIBCO公司,胎牛血清购自杭州四季青公司,CCK-8购自日本同仁化学研究所,CycleTestplus DNA Reagent kit购自Biosciences公司, Annexin V-FITC/PI购自Caltag公司。
, 百拇医药
1.2 主要仪器设备：倒置相差显微镜,德国Leica;酶标仪ELX-800,美国；流式细胞仪FACS Calibur,Becton Dickinson公司。
2 方法
2.1 细胞培养：人鼻咽癌细胞株CNE2贴壁培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养,每周换液2～3次,0.25 %胰酶(内含0.02 %EDTA)消化传代。
2.2 光镜观察苦参碱对CNE2细胞形态的影响：6孔板上每孔接种1×105个CNE2细胞,24小时后,分成空白对照组和用药组,用药组的剂量分别为0.5、1、2mg/ml,48小时用倒置相差显微镜观察并照相记录用药组和对照组细胞的形态变化。
2.3 CCK-8法检测苦参碱对CNE2细胞增殖的影响：取对数生长期的CNE2细胞,消化后重悬,以6×103/孔接种到96孔板,24小时后加入苦参碱,使其终浓度分别为0.25、0.5、1、1.5、2mg/ml，每个浓度设6个平行孔,同时设置空白对照组、溶剂对照组和调零孔。分别在12、24、48和72小时加入CCK-8，混匀后37℃继续孵育2小时，酶标仪450nm波长测OD值。并按下列公式计算细胞增殖抑制率:细胞增殖抑制率(%)=(对照组OD值-用药组OD值)/对照组OD值×100%，绘制抑制率曲线图，半数抑制浓度(IC50)采用Bliss法计算。
, 百拇医药
2.4 流式细胞仪分析苦参碱对CNE2细胞周期的影响：取对数生长期的CNE2细胞，以1×105/孔接种于6孔板中,24小时后加入苦参碱,使其终浓度分别为0.5、1、2mg/ml，并设空白对照组，48小时后收集细胞，用PBS洗涤2次后,按Cycle Testplus DNA Reagent kit试剂盒说明书操作。应用Cellquest3.2分析软件获取,ModFit3.0软件分析结果。
2.5 Annexin V-FITC/PI法检测苦参碱对CNE2细胞凋亡影响：前期处理同细胞周期的检测,用PBS洗2次后，按Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书操作。应用Cellquest3.2分析软件获取和分析结果。
2.6 统计学处理方法：不同药物浓度组间的比较采用one-way ANOVA分析,各药物浓度组与对照组的比较采用Dunnet t检验,以α=0.05为检验水准,采用SPSS13.0数据分析系统。
, http://www.100md.com
3 结果
3.1 苦参碱作用后CNE2细胞形态的变化：苦参碱作用48小时后,0.5mg/ml组的细胞数与对照组相比有所减少,形态变化不明显,1mg/ml组可见部分细胞皱缩，变小变圆,胞内出现空泡,2mg/ml组可见大量细胞皱缩，变小变圆,胞内空泡明显,折光性差,并有部分细胞脱落悬浮于培养液中。详见图1。
3.2 苦参碱对CNE2细胞的增殖抑制作用：CCK-8法检测不同浓度的苦参碱作用于人鼻咽癌细胞CNE2不同时间,对细胞增殖的抑制作用详见图2。结果表明,苦参碱能显著抑制CNE2细胞的增殖,并有明显的剂量效应及时间效应关系。半数抑制浓度(IC50)：48小时为0.710mg/ml,72小时为0.629mg/ml。
3.3 苦参碱对CNE2细胞周期的影响：不同浓度的苦参碱作用于CNE2细胞48小时后,G0/G1期细胞比例增高,S期、G2/M期细胞比例降低，与对照组比较有显著性差异,呈剂量依赖性。详见表1。3.4 苦参碱对CNE2细胞凋亡的影响：Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测结果显示,0.5、1、2mg/ml苦参碱作用48小时后，CNE2细胞凋亡率分别为(7.46±0.97)%、(11.62±1.15)%、(16.56±1.21)%，与对照组(4.23±0.70)%相比较，0.5mg/ml苦参碱组有显著性差异(P<0.05)，1mg/ml、2mg/ml苦参碱组均有非常显著性差异(P<0.01)，结果呈现剂量依赖性。详见图3。
, 百拇医药
4 讨论
体外实验表明苦参碱对多种肿瘤细胞有抑制或杀伤作用,对HepG2、K562、HL260有明显的抑制作用,并能诱导分化和凋亡[4]。本实验发现,0.5mg/ml的苦参碱即可对CNE2细胞造成抑制(P<0.05),并且随着浓度和时间的增加存在量效和时效关系。我们用苦参碱作用CNE2细胞48小时后，各实验组的G0/G1期细胞比例均显著增多，S期、G2/M期比例下降，显示苦参碱能抑制CNE2细胞进入S期，造成G1期阻滞并阻断细胞的DNA合成和复制,从而抑制CNE2细胞增殖。阻滞的G1期细胞有两种选择,进入G0期以完成修复或进入凋亡以清除肿瘤细胞[5]。我们用Annexin V-FITC/PI法检测发现苦参碱作用48小时后，CNE2细胞凋亡率明显增高，并呈剂量依赖性。显微镜下可见细胞形态发生明显改变，细胞皱缩，变小变圆，空泡明显，部分细胞脱落悬浮于培养液中。, http://www.100md.com(李海英 张 力 吴式琇 吴建波 韩义香)