桐庐县中医院 浙江 桐庐 311500

    本实验通过观察附子汤对三种不同病因病机的骨关节炎(OA)模型体重及软骨病理变化，检测不同时间点血清、关节液、软骨组织及滑膜中白细胞介素-1β(IL-1β)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶4(ADAMTS4)和血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5(ADAMTS5)水平的变化，探讨附子汤治疗OA的可能机制，揭示中药对证施治的科学意义，为OA的中医临床治疗和附子汤的二次开发利用提供科学依据。

    1 材料和方法

    1.1 实验动物：健康SPF级雄性SD大鼠，体质量200±20g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK(沪)2018-0006。饲养条件：恒温，温度22±2oC，湿度50%～60%，14h光照和10h黑暗的环境明暗交替，换风次数15～20次/小时。由浙江中医药大学动物实验研究中心饲养。实验饲养室许可证号：SYXK(浙)2018-0012。

    1.2 实验药物、试剂及仪器：附子汤由制附子、白术各12g，茯苓、白芍各9g，人参6g等药组成。加水提取2次，每次1.5h，减压浓缩至2g生药/ml的药液，备用。大鼠MMP-13 ELISA试剂盒(武汉酶免公司)，大鼠ADAMTS4、ADAMTS5 ELISA试剂盒(LifeSpan Biosciences公司)；Trizol(生工生物)；SYBR Green qPCR试剂盒，逆转录试剂盒(康为世纪)；酶标仪(MD公司)，低速离心机(Thermo Scientific)，普通PCR仪(Eppendorf公司)，核酸定量仪(Thermo Scientific)，qPCR仪(罗氏公司)。

    1.3 动物造模：①寒湿痹阻OA模型：根据其平均膝关节大小设计可固定的双层金属关节套管，套管夹层可放入碎冰和水，对每只鼠膝关节进行束缚冰浴，每天早晚各1次，每次2h，持续12周。②机械损伤OA模型：采用改良的Hulth韧带/半月板损伤方法[1]，SD大鼠常规剪毛、消毒，采用10%水合氯醛进行腹腔注射麻醉；无菌条件下，取膝关节内侧切口，充分显露膝关节，切断内侧副韧带、前交叉韧带，摘除内侧半月板；术后3d给予80万单位青霉素肌肉注射。③化学损伤OA模型：采用经典的碘乙酸关节腔注射方法[2]，SD大鼠在无菌条件下，10%水合氯醛腹腔注射(0.3ml/100g)麻醉，麻醉后大鼠仰卧位固定于操作台，剃须刀剃除双侧膝关节周围绒毛，用酒精棉球擦拭2遍，术者微屈大鼠膝关节以微量注射器由髌骨内侧下方斜上刺入关节腔 ......