谭波 魏人前 杨志明 李秀群 韩平 智伟 解慧琪 任燕 谭中侠

    (四川大学华西医院 生物治疗国家重点实验室,四川 成都610041)

    关于口腔颌面部外伤或肿瘤术后所致的口腔黏膜大面积缺损的修复，传统的治疗方法常利用自体皮片移植法和脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix，ADM)修复口腔，以改善其功能，具有较大的局限性。运用组织工程技术构建口腔黏膜，将为口腔缺损的修复提供一条崭新的道路，其基本技术路线包括种子细胞的培养、支架材料的研制、细胞与支架材料的相互作用以及工程化黏膜组织的构建等[1]。小肠黏膜下层(small intestinal submucosa，SIS)是一种具有引导/诱导组织再生的膜材料，有较多实验证实其用于修复重建膀胱、尿道等有良好的组织相容性[2-3]。但SIS在口腔黏膜缺损的应用、口腔黏膜上皮细胞(oral mucosal epithelial cells，OMECs)能否在SIS生长及其与SIS的相容性如何，则很少报道。本研究采用含6%胎牛血清和添加多种成份的上皮细胞无血清培养基(defined keratinocyte serum free medium，DKSFM)为基础培养基，采用酶消化法进行体外连续培养犬OMECs，探索原代及体外连续培养OMECs的方法。通过观察OMECs在SIS上的生长、增殖情况，评价SIS的生物相容性，为组织工程口腔黏膜寻找合适的支架材料。同时,也可为临床上常用于修复腭[4]、角膜、颊黏膜、皮肤的口腔黏膜进一步构建工程化黏膜组织提供实验依据。

    1 材料和方法

    1.1 主要材料及仪器

    2～5周龄幼犬10只，雌雄不限，体重1～2 kg，由四川大学华西医院动物实验中心提供。DKSFM和Dispase酶(Gibco公司，美国)、胰蛋白酶、胎牛血清(Hyclone公司，美国)，口灵(云南三利消毒药业有限公司)，细胞培养箱(Sanyo公司，日本)，SIS(由四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室的干细胞与组织工程研究室提供)，倒置相差显微镜(Olympus公司，日本)，荧光生物显微镜(Nikon公司，日本)，扫描电镜(Jeol公司，日本)，鼠抗人细胞角蛋白CK19单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司提供)。

    1.2 OMECs的分离、培养及生物学性状的检测

    1.2.1 口腔黏膜的分离 无菌条件下取幼犬正常口腔黏膜约3 cm×3 cm×3 cm，参照文献[5-7]沿纵轴切开后，将口腔黏膜层与肌层分开 ......