张朝良 孔祥丽 陈思秀 李小玉

    (口腔疾病研究国家重点实验室,四川大学,四川 成都 610041)

    牙周病是由以牙菌斑中的微生物为主，多种因素作用所引起的牙周支持组织慢性感染性疾病，是成年人失牙的主要原因[1]。其临床病理特点为牙周软硬组织呈进行性不可逆性的破坏。目前牙周病治疗的最终目的是牙周组织的再生、重建和功能的恢复。牙周膜细胞(periodontal ligament cells，PDLCs)能合成和分泌大量胶原物质，具有多向分化潜能，其前体细胞能分化出成牙骨质细胞、成骨细胞和成纤维细胞，维持牙周组织的相对稳定，是牙周炎治疗后牙周新附着形成的主要细胞来源，是牙周组织再生的基础。目前研究[2]表明，多种生长因子对PDLCs增殖分化和细胞外基质合成有促进作用。

    中药黄芪的活性成分黄芪多糖对成骨细胞的体外增殖与分化具有一定作用。黄芪化学成分众多，主要含有多糖类、皂苷类、黄酮类以及氨基酸类等。黄芪中多糖含量为2.53%，相对分子质量为1万～5万。黄芪水提取液中含有3种黄芪多糖(Astragalus membranaceus，APS)，即APSⅠ、Ⅱ、Ⅲ。其中APSⅠ是杂多糖，由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖组成，相对分子质量36 300，APSⅡ、Ⅲ均为葡聚糖[3]。因此，本文通过体外培养人牙周膜细胞，观察黄芪多糖对其增殖、分化能力以及结构的影响，以期为口腔生物工程细胞培养提供有效的理论基础。

    1 材料和方法

    1.1 主要试剂和仪器

    DMEM培养基(Gibco公司，美国)，小牛血清(Hyclone公司，美国)，胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)(Sigma公司，美国)，多聚甲醛、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)等均购于郑州化学试剂三厂。CO2培养箱(Heraeus公司，德国)，倒置相差显微镜(Nikon公司，日本)。

    1.2 人牙周膜细胞体外分离培养

    在临床上取得因正畸拔除的健康牙，置含双抗的DMEM培养基中，立即送到实验室，在无菌条件下将牙放入双抗中5～10min，取出在培养皿里除去其他牙龈组织；用PBS洗2次，再用刀片刮取根中部1/3的牙周膜组织，用0.1%Ⅰ型胶原酶3mL冲洗后吸入25mL培养瓶里 ......