牙龈卟啉单胞菌PG0839基因突变株的构建(3)
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参见附件。
1.6 载体的电穿孔转化[5]
将1 mL处于对数生长期的P.gingivalis W83菌液接种于10 mL新鲜配制的BHI液体培养基中，37 ℃厌氧培养过夜。取3 mL过夜培养的菌液加入到90 mL新鲜配制的BHI液体培养基(预加热至37 ℃)中，孵育4 h。
3 000 g、4 ℃离心15 min以收集细菌细胞，50 mL电穿孔缓冲液(10%甘油加1 mmol·L-1 MgCl2，过滤除
菌，4 ℃保存)洗涤2次后，0.5 mL电穿孔缓冲液重悬细胞沉淀。将100 μL细胞悬液和1 μg DNA共同加入
到一个无菌电极杯中，电穿孔脉冲为2 440 V、5 ms，电穿孔后，冰浴5 min。
1.7 突变株的筛选
将细胞悬液接种于1 mL BHI液体培养基，37 ℃厌氧培养16 h后，取300 μL菌液接种于新鲜配制的抗性BHI培养基(含5 μg红霉素)，记为实验组；分别
在抗性和非抗性BHI培养基上接种P.gingivalis W83菌株，作为对照组1和2。37 ℃厌氧培养7 d。收集实验组中阳性克隆菌体，即为PG0839基因突变菌株。
1.8 突变株的检测
1.8.1 P.gingivalis 16S rRNA特异性引物检测 提取细菌DNA。对PG0839基因突变菌株进行P ......
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