活化Notch2信号促进高糖条件下破骨细胞分化的体外研究(2)
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参见附件。
1.6 抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid pho-
sphatase，TRAP)染色
将在高糖或等渗甘露醇培养条件下受RANKL诱导的破骨前体细胞、ICN2-OE及EMPTY，用PBS洗2次，4%甲醛固定液室温固定10 min，PBS洗2次，甲醇和丙酮混合液(体积比1∶1)固定3～5 min，PBS洗2次，37 ℃条件下用TRAP染色液染色10 min，双蒸水洗3次，光镜观察并计数破骨细胞。多核(细胞核数目≥3个)且TRAP染色阳性的细胞视为破骨细胞。
TRAP染色液配方：N，N-二甲基甲酰胺500 μL、磷酸萘酚5 mg、TRAP缓冲液50 mL、固红紫色LB磷酸盐30 mg；其中TRAP缓冲液配制方法为：醋酸1 mL、三水合乙酸钠6.8 g、酒石酸钠二水11.5 g，加双蒸水溶解至1 000 mL。
1.7 RNA的提取、cDNA制备及实时定量PCR分析
将高糖或等渗甘露醇培养条件下，受RANKL诱导的破骨前体细胞，用TRIzol试剂一步法抽提细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA260 nm/RNA280 nm吸光度值以检测RNA样品的纯度和浓度；然后按FERMEN-TAS逆转录试剂盒标明的操作步骤进行实时定量PCR，cDNA合成在42 ℃进行60 min，70 ℃灭活5 min。用SYBR GREEN试剂盒进行实时定量PCR分析。利用Primer Express 2.0设计针对Notch2基因与内参照β-
actin的引物如下：小鼠Notch2正义链5’-CCCCTTGC-CCTCTATGTACCA-3’ ......
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