SV40Tag基因片段转染SD大鼠牙囊细胞后相关生物学特性初步研究(2)
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采用蛋白质印迹技术(Western blot)检测转染
SV40Tag基因前后DFC端粒酶的表达。以转染SV40-Tag后的DFC为实验组，正常DFC为对照组。用预冷的PBS液清洗细胞，提取蛋白质于-20 ℃保存。配置工作液，酶标仪测定562 nm处的吸光度，绘制标准曲线蛋白定量。上样50 μg进行电泳，转膜，去除气泡，同时保持胶的湿润。将其放入电泳槽，胶面向阴极，然后放入充满缓冲液的缓冲槽，4 ℃电泳过夜后取出，弃胶。将膜放入染液中快速染色，然后放置于封闭液中，37 ℃下摇晃4 h。5%的脱脂奶粉脱色摇床上洗膜15 min，封TRT一抗(1∶400)4 h，封二抗(1∶2 000)2 h，洗膜，显影。应用Image tool V
3.0图像分析软件进行图像分析，计算转染SV40Tag基因前后DFC的灰度值以及相应的内参GAPDH灰度值。
1.5 转染SV40Tag基因前后DFC成骨分化相关基因
表达的检测
采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription PCR，RT-PCR)检测转染SV40Tag基因前后DFC成骨分化相关基因的表达。以转染SV40Tag后的DFC为实验组，正常DFC为对照组，细胞消化后接种于96孔板，培养于加有矿化诱导液(地塞米松1×10-8 mol·L-1，β-甘油磷酸钠50 mg·L-1，维生素C 10 mmol·L-1)的培养基中诱导其骨向分化 ......
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