SV40Tag基因片段转染SD大鼠牙囊细胞后相关生物学特性初步研究(2)
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参见附件。
采用蛋白质印迹技术(Western blot)检测转染
SV40Tag基因前后DFC端粒酶的表达。以转染SV40-Tag后的DFC为实验组,正常DFC为对照组。用预冷的PBS液清洗细胞,提取蛋白质于-20 ℃保存。配置工作液,酶标仪测定562 nm处的吸光度,绘制标准曲线蛋白定量。上样50 μg进行电泳,转膜,去除气泡,同时保持胶的湿润。将其放入电泳槽,胶面向阴极,然后放入充满缓冲液的缓冲槽,4 ℃电泳过夜后取出,弃胶。将膜放入染液中快速染色,然后放置于封闭液中,37 ℃下摇晃4 h。5%的脱脂奶粉脱色摇床上洗膜15 min,封TRT一抗(1∶400)4 h,封二抗(1∶2 000)2 h,洗膜,显影。应用Image tool V
3.0图像分析软件进行图像分析,计算转染SV40Tag基因前后DFC的灰度值以及相应的内参GAPDH灰度值。
1.5 转染SV40Tag基因前后DFC成骨分化相关基因
表达的检测
采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription PCR,RT-PCR)检测转染SV40Tag基因前后DFC成骨分化相关基因的表达。以转染SV40Tag后的DFC为实验组,正常DFC为对照组,细胞消化后接种于96孔板,培养于加有矿化诱导液(地塞米松1×10-8 mol·L-1,β-甘油磷酸钠50 mg·L-1,维生素C 10 mmol·L-1)的培养基中诱导其骨向分化 ......
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