不同龋敏感儿童菌斑中变异链球菌数量及菌群比例的定量分析(2)
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参见附件。
1.2.5 DNA浓度测定 使用BioNano超微量紫外可见分光光度计测定10倍倍比稀释的变异链球菌标准菌株和样本总菌DNA浓度和纯度。A260/A280为1.8～2.0，表明纯度合格。根据测得的变异链球菌标准菌株浓度与循环阈值(Ct值)对应关系，计算有龋组和无龋组变异链球菌浓度及其在总菌中所占比例。
1.2.6 引物及探针合成 变异链球菌特异性引物及探针和细菌通用引物及探针的设计参考文献[6，11]。引物和TaqMan探针(5’-FAM，3’-TAMRA)均由北京赛百盛基因技术有限公司合成，具体见表1。
1.2.7 实时荧光定量PCR及产物分析 变异链球菌标准菌株复苏、纯分和增菌后进行10倍倍比稀释，各稀释浓度菌液分别进行菌落培养计数及DNA提取(见1.2.4)，绘制标准曲线。将标准菌株和样本DNA在ABI 7500型定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR。反应条件为50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，然后95 ℃ 15 s，变异链球菌和总菌退火延伸温度分别为60 ℃和68 ℃ 1 min，进行40个循环。反应试剂盒为Taq-Man Universal PCR Master Mix；反应体系总体积为20 μL，包括TaqMan Universal PCR Master Mix(2×)10 μL，正反引物(2 μmol·L-1)各2 μL，TaqMan探针(2.5 μmol·L-1)为2 μL，待测DNA模板为1 μL，ddH2O 3 μL。
1.3 数据分析
采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行分析。使用卡方检验比较有龋组和无龋组变异链球菌检出率的差异；使用Wilcoxon秩和检验对有龋组和无龋组变异链球菌数量、总菌数量及变异链球菌占总菌数比例的差异进行分析，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 标准曲线的绘制
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