人Notch-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定(2)
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参见附件。
涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carci-noma,SACC)是涎腺常见的恶性肿瘤,国内统计其占涎腺肿瘤的9.9%[1],国外统计其占涎腺肿瘤的7.5%[2]。SACC的恶性程度高,主要表现为侵袭性强,局部易复发;易远处转移,以肺转移多见,转移率高达40%;有典型嗜神经性,早期即可沿神经侵袭和转移,导致面瘫、麻木、疼痛等神经受损症状,给临床治疗带来很大的困难,预后差[2]。本课题前期研究已成功构建了SACC嗜神经侵袭基因表达谱,Notch-1即为其中重要差异表达基因之一[3]。
Notch信号途径是一个进化上保守的信号转导通路,在调节细胞的分化、增殖与凋亡中起重要作用。Notch信号途径的异常调控可引起组织的发育异常,并最终导致肿瘤等多种疾病的发生[4]。研究[5]表明,Notch家族基因Notch-1、Notch-2、Notch-4与SACC的发生、发展、转移有关,但其与SACC嗜神经侵袭行为间的关系尚未见报道。本研究的目的是构建人Notch-1基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体,并对其进行鉴定,寻找最佳RNAi慢病毒载体,为探讨Notch-1在SACC中的功能与分子机制奠定基础。
1 材料和方法
1.1 主要材料
慢病毒载体pLenOR-THM(上海英为信生物科技有限公司),配有3个包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G。Taq DNA聚合酶、限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ(Takara公司,日本),T4 DNA连接酶(NEB北京有限公司),AxyPrep质粒小量制备试剂盒(Axygen公司,美国),Nucleo-Bond Xtra Midi Plus质粒纯化试剂盒(Macherey-Nagel公司,德国),高效感受态细胞制备试剂盒(上海生物工程有限公司),大肠杆菌菌株DH5α、RPMI-
1640和DMEM培养基、LipofectaminTM2000、胰蛋白酶、Trizol(Invitrogen公司 ......
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