何飞 吴勇 周艳

    深圳市人民医院口腔科，深圳 518020

    破骨细胞分化的激活和功能亢进是导致牙周病牙槽骨吸收的关键环节。研究破骨细胞分化的信号调控，可以进一步了解牙周病骨吸收原理；阻断破骨细胞分化信号通路，也可能成为防止牙周病牙槽骨吸收的有效策略。已有的研究[1-4]显示， Notch信号是破骨细胞分化调控的关键信号之一，但其具体作用尚存在不同意见。本研究旨在初步探讨Notch信号在体外破骨前体细胞RAW264.7分化中的作用，为进一步明确其作用的分子机制奠定基础。

    1 材料和方法

    1.1 材料和试剂

    小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞株(ATCC)，DMEM、特级胎牛血清(Gibco公司，美国)，鼠重组细胞核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)(Peprotech公司，美国)，γ分泌酶抑制剂(γ-secretase inhibitor，GSI)(L685，458，Calbiochem公司，美国)，破骨细胞分化标志物抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphase，TRAP)染色试剂盒(Sigma公司，美国)。

    1.2 破骨细胞分化诱导

    将RAW264.7细胞复苏后应用高糖DMEM进行培养，每隔3 d细胞换液1次，细胞铺满即可进行传代。为检测Notch信号抑制对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响，本研究将不同浓度GSI与RANKL共同加入培养液。将细胞分为3组：阴性对照组(即空白对照组)，RANKL诱导组(50 ng·mL-1)，RANKL(50 ng·mL-1)+GSI(1、2、5 μmol·L-1)组。

    1.3 实时定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction，real-time PCR)

    采用TRIzol试剂一步法抽提RAW264.7细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA260 nm/RNA280 nm光密度值以检测RNA样品的纯度和浓度；然后按FERMENTAS逆转录试剂盒标明的操作步骤进行real-time PCR ......