肖文林 庄翠竹 时艳 许尧祥 薛令法

    青岛大学附属医院口腔颌面外科；山东省教育厅口腔临床医学重点实验室，青岛 266555

    7-脱氢胆固醇还原酶(7-dehydrocholesterol reductase，Dhcr7)基因突变将导致Dhcr7活性下降，胆固醇水平降低，其前体7脱氢胆甾醇等在体内聚集，发生包括腭裂在内的多发生长和发育畸形[1]。抑制Dhcr7的活性，可以阻碍胆固醇的代谢，阻断信号通路而引起一系列缺陷综合征[2-3]。本课题组发现，Dhcr7基因在腭突发育的关键时期有表达，并且表达量随着腭突的发育而变化，Dhcr7基因主要表达在腭突间充质细胞；进而通过培养腭突间充质细胞，筛选出针对Dhcr7的最有效小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)序列[4]。此外，本课题组改进了腭突的取材方法和培养方式，成功进行了腭突的体外器官培养[5]。本实验在前期研究的基础上，应用体外腭突器官培养技术，通过腺病毒转染siRNA沉默Dhcr7基因表达，研究Dhcr7基因在腭突融合中的作用。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    8～9周的C57BL/6J近交系小鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司)。DIGDNA标志和检测试剂盒(深圳依诺金公司)；人胚肾293T细胞(北京三元基因工程有限公司)；DMΕM/F12(质量比1∶1)培养基(HyClone公司，美国)；siRNA序列(上海吉玛制药技术有限公司)；Lipofectamine 2000、二甲基亚砜(Invitrogen公司，美国)；Dhcr7逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)引物5’-TTTCCTGCTGCTCTTCGCTC-3’和 3’-CTTGGACGCCTCCCACATAA-5’，β-actin引物5’-GAACCCTAAGGCCAACC-3’和3’-TGTCACGCACGATTTCC-5’(上海生工生物有限公司)；质粒提取试剂盒、限制性内切酶和T4DNA连接酶、Trizol RNA提取试剂、PrimeScript RT-PCR Kit(日本宝生物工程有限公司)；Dhcr7抗体(Abcam公司，美国)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)单克隆抗体、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标志的山羊抗兔和小鼠IgG二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)；Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate、滤膜(Millipore公司 ......