包广洁 孔楠楠 郭曼丽 苏雪莲 康宏

    1.西北民族大学口腔医学国家民族事务委员会重点实验室，兰州 730030；2.兰州大学口腔医学研究所，兰州 730000

    颞下颌关节盘是位于颞骨关节窝和下颌骨髁突之间的纤维软骨样组织，在颞下颌关节行使功能过程中起到缓冲应力的作用[1]。随着年龄和颞下颌关节功能位置、负荷大小的改变，颞下颌关节盘也会发生相应的组织改建[2]。据报道[3]，有20%～50%的人由于关节盘变性、变薄、穿孔等原因罹患关节盘功能障碍性疾病；而目前的治疗方法除了手术摘除之外，仍缺乏其他有效的措施。

    细胞替代疗法是迄今最有前景的治疗关节软骨缺损的方法[4]，该方法中种子细胞的选择非常关键。自体或异体的颞下颌关节盘细胞是重要的种子细胞来源，目前对其分类和分型已取得了初步进展，从组织学上可分为软骨细胞样细胞和成纤维细胞样细胞[5-7]，但两种类型的细胞在生物力学方面的反应特性尚不清楚。

    生物原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM)[8]具有纳米级分辨率，且易于操作，便于定量测定生物样本的结构和力学性能，因而广泛用于细胞形态和生物力学研究中[9]。AFM通过高度灵敏的悬臂获取细胞的形态结构、刚度和黏附力[10]，这些特征可以揭示细胞的表面结构和力学性能以及与细胞功能之间的关系。本研究通过AFM接触模式获取颞下颌关节盘软骨细胞样细胞和成纤维细胞样细胞的超微形貌特征，通过AFM力学模式获取相关数据，对比细胞弹性和黏附力，探索颞下颌关节盘细胞的生物力学特性，为工程化颞下颌关节盘组织的后续研究提供依据。

    1 材料和方法

    1.1 关节盘细胞的分离与培养

    分批购置新鲜屠宰的1月龄山羊头，充分清洁，75%乙醇中浸泡30 min。在无菌条件下取出双侧颞下颌关节盘，修剪周围组织，用含100 U·mL-1青霉素和0.1 g·L-1链霉素双抗的PBS充分冲洗3次，移入50 mL小烧杯中，将其剪碎至约1 mm3大小；加10 mL 0.2%Ⅰ型胶原酶(Sigma公司，美国)，于37 ℃、86 r·min-1摇床上消化15 h。H-DMEM培养液(Hyclone公司，美国)重悬离心，收集细胞。一部分细胞以每毫升1×105个的密度接种于培养皿(无锡耐思生物科技有限公司)中，另一部分按每毫升2×105个的密度接种于50 mL培养瓶；加5 mL完全培养液，其中含有15%胎牛血清(杭州四季青生物科技有限公司)、1%维生素C(Sigma公司，美国)、2 mmoL·L-1谷氨酰胺(Sigma公司 ......