邱伟 程兴群 周学东 李雨庆

    口腔疾病研究国家重点实验室 华西口腔医院(四川大学)，成都 610041

    c-di-AMP[1]是近些年继cAMP、c-di-GMP后新发现的一种在细菌和支原体中广泛存在的环核苷酸第二信使分子，这些细菌包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[1-3]、单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)[4-6]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[7]、肺炎链球菌(Streptococcus pyogenes)[8]、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)[9]、乳杆乳球菌(Lactococcus lactis)[10]。c-di-AMP能够调控多种细菌生理活动，与多种致病微生物的毒力因子密切相关。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)是革兰氏阴性、专性厌氧的产黑色素杆菌，是目前公认的牙周炎主要病原菌之一[11-12]。本课题组通过前期的生物信息学分析发现，在牙龈卟啉单胞菌的基因组中存在一个c-di-AMP合成酶的编码基因(pgn0523)和两个c-di-AMP分解酶的编码基因(pgn1187，pgn2003)。本实验拟通过对这3个牙龈卟啉单胞菌第二信使分子c-di-AMP合成和分解代谢相关基因进行克隆以及表达纯化，得到较高浓度和纯度的目的蛋白，为进一步推测牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP的体内代谢途径、探究c-di-AMP对牙龈卟啉单胞菌的生长及毒力的调控作用等奠定理论基础，为牙周炎疾病的防治提供新的理论依据。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    pET-28a载体(Novagen公司，德国)，T4 DNA连接酶(TaKaRa公司，日本)，Taq DNA聚合酶(Toyobo公司，日本)，限制性核酸内切酶XbaⅠ和NotⅠ(TaKaRa公司，日本)，Ni-Sepharose 6 Fast Flow(GE Healthcare公司，美国)，基因组DNA抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、柱式质粒小量抽提试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]，BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，实验引物合成、DNA序列测定[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

    1.2 菌种和培养基

    牙龈卟啉单胞菌ATCC33277(四川大学口腔疾病研究国家重点实验室)，大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞、BL21(DE3)感受态细胞[天根生化科技(北京)有限公司] ......