付小娟 杨凯 李晗雪 赵钦 陈丹重庆医科大学附属第一医院口腔颌面外科，重庆 400016

    生物钟基因Per1对人口腔鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡、细胞周期和体内成瘤的影响及机理

    付小娟杨凯李晗雪赵钦陈丹

    重庆医科大学附属第一医院口腔颌面外科，重庆 400016

    [摘要]目的探讨生物钟基因Per1对细胞周期相关基因的调控作用，以及对人口腔鳞状细胞癌细胞SCC15增殖、凋亡、细胞周期和体内成瘤的影响。方法构建3组针对Per1 RNA的短发夹RNA(shRNA)慢病毒重组质粒，转染SCC15细胞，用蛋白质印迹法(Western blot)及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测筛选RNA干扰作用最强组为实验组，对照组(Control-shRNA)为对任何基因均无干扰效应的shRNA序列的质粒，空白组为未做任何处理的SCC15细胞。用qRT-PCR检测各组细胞中细胞周期相关基因Per1、p53、Cyclin D1、Cyclin E、Cyclin A2、Cyclin B1、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、p16、p21、Wee1、cdc25、E2F、Rb1 mRNA的表达；用流式细胞仪检测各组细胞增殖、凋亡和细胞周期分布；将实验组和空白组细胞分别接种于裸鼠背部皮下，观察成瘤情况。结果成功构建了3组Per1-shRNA慢病毒质粒，通过qRT-PCR和Western blot证明Per1-shRNA-Ⅰ组沉默效果最佳，作为实验组。Per1-shRNA-Ⅰ组中Cyclin D1、Cyclin E、Cyclin B1、CDK1和Wee1 mRNA的表达水平高于Control-shRNA组和SCC15组(P0.05)。CDK2、CDK4、CDK6、E2F和Rb1 mRNA的表达水平在3组中均无统计学差异(P>0.05)。Per1-shRNA-Ⅰ组中细胞增殖指数高于Control-shRNA组和SCC15组(P0.05)。Per1-shRNA-Ⅰ组细胞体内成瘤能力显著增强(P1 材料和方法

    1.1细胞和主要试剂

    人口腔鳞状细胞癌SCC15细胞(重庆医科大学生命科学院)，慢病毒表达载体PLKO.1(Sigma公司，美国)，质粒提取试剂盒(Invitrogen公司，美国)，逆转录试剂盒(TaKaRa公司，日本)；逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chainreaction，RT-PCR)试剂盒(Bio-Rad公司，美国)，BCA蛋白浓度测定试剂盒、鼠抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ......