林洁王淼吉阳刘乐高攀李春洁

    1.口腔疾病研究国家重点实验室 华西口腔医院口腔麻醉科(四川大学)；2.头颈肿瘤外科，成都 610041

    脾络氨酸激酶-核因子κB 调控口腔癌相关巨噬细胞中癌痛相关环氧化酶2的机制研究

    林洁1王淼1吉阳1刘乐1高攀2李春洁2

    1.口腔疾病研究国家重点实验室 华西口腔医院口腔麻醉科(四川大学)；2.头颈肿瘤外科，成都 610041

    目的 通过体外原代巨噬细胞诱导以及分子生物学的方法，探究口腔癌相关巨噬细胞环氧化酶2(COX-2)上调的机制。方法 构建小鼠原代巨噬细胞，使用Cal27条件培养基(CM)刺激诱导形成口腔癌相关巨噬细胞，使用免疫荧光检测原代巨噬细胞的纯度。使用小分子抑制剂分别抑制脾络氨酸激酶(Syk)及核因子κB(NFκB)通路。使用实时定量聚合酶链反应(PCR)、Western blot检测COX-2及信号通路相关蛋白的变化。结果 所诱导的原代巨噬细胞均特异性表达CD68蛋白。Cal27 CM刺激能够显著提高COX-2的表达(P1 材料和方法

    1.1 试剂和仪器

    DMEM/F12培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、10×PBS、胰蛋白酶(Gibco公司，美国)，重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)(PeproTech公司，美国)，40 μm细胞滤网(BD公司，美国)，兔抗鼠COX-2抗体(Santa Cruz公司，美国)，异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)直标兔抗鼠CD68抗体(Biolegend公司，美国)，鼠抗鼠磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体(Millipore公司，美国)，鼠抗鼠Syk抗体、兔抗鼠磷酸化Syk抗体(Abcam公司，美国)，鼠抗鼠p65抗体、兔抗鼠磷酸化p65抗体(Cell Signalling公司，美国)，IRDey800直标羊抗兔IgG、IRDey800直标兔抗鼠IgG、IRDey800直标驴抗羊IgG(Rockland公司，美国)，Bay11-7082、白皮杉醇(piceatannol，PIC)(上海Selleck公司)，预染蛋白质相对分子质量标准液(Invitrogen公司，美国)。PureLink?RNA小量试剂盒(Life technologies公司，日本)，逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction ......