田鲲 冯小云 杜芹 廖楚航 任小华

    电子科技大学附属医院·四川省人民医院口腔科，成都 610072

    人釉原蛋白亮氨酸富集片段的冷冻电子显微镜观察及其引导矿化性能研究

    田鲲 冯小云 杜芹 廖楚航 任小华

    电子科技大学附属医院·四川省人民医院口腔科，成都 610072

    目的 采用冷冻电子显微镜观察体外重组的人釉原蛋白富亮氨酸片段(LRAP)，分析其细微结构和聚集状态，结合矿化实验评估LRAP体外引导羟磷灰石生长的定向成核能力。方法 人工合成LRAP基因，与原核表达载体pCold-SUMO行质粒构建，于宿主菌大肠杆菌BL21plys中诱导表达并纯化，在冷冻电子显微镜下观察LRAP在pH值从3.5到8.0的环境中聚合自组装的过程，并在人工唾液中通过透射电镜观察羟磷灰石晶体的生长规律。结果 通过原核表达成功得到纯度90%以上的LRAP蛋白提取物，当pH值为8.0时，LRAP能聚集成多聚体和纳米小球等功能结构，在人工唾液中能诱导羟磷灰石晶体生长成熟。结论 作为简化的釉原蛋白功能域，LRAP兼备了自组装为纳米小球和c轴诱导晶体矿化的特性，可作为运用釉基质蛋白多聚物行无细胞修复牙体硬组织缺损的备选材料之一。

    冷冻电子显微镜； 釉原蛋白； 釉原蛋白亮氨酸富集片段； 羟磷灰石

    近年来， 依据仿生矿化原理，体外搭建高度仿真的有机矿化模板，营造合适的钙、磷微环境逐步成为釉质晶体再生的可行方法。仿真矿化模板也经历了从最初简单的高分子到复杂多肽，再到直接提取体内釉质矿化模板的发展历程[1-3]。组成釉质的无机晶体组分是完全相同的，但它能达到普通磷酸钙硬度的5倍，唯一的差别就是晶体生长和组装的取向。釉柱和柱间质形成网球拍样结构，二者的差异是由矿化模板中纳米纤维长轴转角来架构的：其过程是成釉细胞的分泌单位Tomes突从两个位点分泌互成60°夹角的蛋白，在空间的排列走势分为辐射向和切线向，循着正弦曲线移动而形成网球拍样的人牙釉柱结构[4-5]。已有研究[4]佐证，矿化模板对釉基质的模仿程度越高，生成的羟磷灰石晶体就越接近牙齿釉柱的排列；相关基因敲除的小鼠，在釉质结构编排或羟磷灰石结晶相上均存在发育缺陷。近年来对釉基质蛋白特别是釉原蛋白的深入破解和探索成为研究釉质仿生合成的主流，故本实验拟对发育中的原位引导蛋白加以利用，体外再现牙体组织缺损处有机模板编织框架的过程，无缝延长这种编织模式，实现晶核的生长和发育。

    造就釉质独特结构的主体是釉质发育期由成釉细胞分泌的釉基质蛋白， 釉原蛋白占全部釉基质蛋白的90%，是最主要的釉质形成蛋白 ......