康迪 李雨庆 周学东

    口腔疾病研究国家重点实验室，国家口腔疾病临床研究中心，四川大学华西口腔医院，成都 610041

    ·基础研究·

    变异链球菌低pH感应系统的构建

    康迪 李雨庆 周学东

    口腔疾病研究国家重点实验室，国家口腔疾病临床研究中心，四川大学华西口腔医院，成都 610041

    目的 构建变异链球菌低pH感应系统，原位可视地检测其所处环境的pH。方法 通过聚合酶链反应(PCR)和基因重组技术，克隆得到唾液链球菌57.I的ureⅠ基因启动子片段(pureⅠ)及绿色荧光蛋白(GFP)的编码基因gfp，经过酶切后将两个基因片段连接融合，然后再经双酶切将融合片段与大肠杆菌-变异链球菌穿梭载体pDL278连接，构建出重组质粒pDL278-pureⅠ-gfp。将重组质粒转化到变异链球菌UA159中，使用荧光显微镜观察其在不同pH条件和不同处理时间的单位面积荧光强度。结果 目的基因pureⅠ和gfp扩增片段大小分别为450 bp和717 bp，与预期大小相符。构建的重组质粒pDL278-pureⅠ-gfp测序结果与数据库比对完全一致。重组变异链球菌低pH报告菌株PCR扩增片段与预期结果相符。在一定范围内，变异链球菌低pH感应系统单位面积荧光强度随pH值的降低和处理时间的延长而增强。结论 本研究成功构建了变异链球菌低pH感应系统，同时验证了唾液链球菌酸诱导启动子pureⅠ能在变异链球菌中正常发挥功能，为今后研究菌斑生物膜中原位pH的动态变化提供了新方法。

    变异链球菌； 唾液链球菌； 绿色荧光蛋白； 尿素酶； 启动子

    龋病是口腔常见的感染性疾病之一。牙菌斑生物膜的形成是龋病形成的首要因素，而变异链球菌则是牙菌斑中主要的致龋菌之一[1-2]。变异链球菌等产酸细菌通过分解糖类产酸，降低菌斑局部pH使牙面脱矿，最终形成龋损[3]。这些酸性代谢产物是造成牙齿脱矿最直接的原因[4]。目前，检测菌斑基质中pH值主要采用pH染料、微电极等方法，但这些测量方法常为非原位测量的方法，易带入其他混杂因素[4-5]。

    唾液链球菌是口腔中的主要产碱菌，在酸性环境中可被诱导产碱，以调节环境pH[6-7]。产生此特性的分子机制是：在高pH环境下，CodY蛋白与尿素酶基因ureⅠ启动子(promoter of ureaseⅠ，pureⅠ)结合，阻遏下游基因表达；在低pH环境下，CodY蛋白从pureⅠ上解离，启动下游基因表达[6]。绿色荧光蛋白(green fluores-cence protein，GFP)常作为报告基团 ......