陈璇 刘海霞 彭显 邹玲

    口腔疾病研究国家重点实验室?国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙体牙髓病科，成都?610041

    利用框内缺失法构建变异链球菌srtA基因缺失株

    陈璇 刘海霞 彭显 邹玲

    口腔疾病研究国家重点实验室?国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙体牙髓病科，成都?610041

    目的 ?利用框内缺失法，通过IFDC2基因盒及融合聚合酶链反应(PCR)、同源重组技术构建变异链球菌UA159菌株srtA基因缺失株。方法 ?PCR扩增变异链球菌UA159菌株srtA基因上下游同源片段及IFDC2基因盒，将这些片段连接、转化入UA159，替换srtA基因同源片段，筛选、鉴定红霉素抗性克隆；PCR扩增、连接UA159?srtA基因上下游同源片段，将连接片段转化入前述红霉素抗性克隆中替换IFDC2同源片段，筛选、鉴定抗苯丙氨酸类似物p-chloro-phenylalanine(p-Cl-Phe)克隆。结果 ?PCR、琼脂糖凝胶电泳及DNA测序结果均证明srtA基因编码区被完全删除，上下游片段无缝连接，成功构建UA159?srtA基因缺失株。结论 ?本研究成功构建了无标记的变异链球菌UA159?srtA基因缺失株，为进一步研究该基因在生物膜中的作用及其调控机制奠定了基础。

    变异链球菌； srtA基因缺失； 框内缺失法

    龋病是发生在牙齿硬组织的慢性感染性疾病[1]。变异链球菌是公认的主要致龋菌之一[1-3]，其致龋毒力主要包括：促进细菌在牙齿表面的聚集和黏附、较强的产酸和耐酸能力等[3]。细菌黏附至牙齿表面并形成生物膜是龋病发生的必要条件[1,3]。变异链球菌表面蛋白P1、GpbC及WapA等都与其黏附能力紧密相关[1,4]，而这些蛋白都是由变异链球菌srtA基因编码的分选酶sortase?A(SrtA)识别并共价锚定到菌细胞壁上发挥作用的[3,5]。变异链球菌srtA基因缺陷可导致其表面蛋白P1等的分布和功能障碍，从而抑制变异链球菌在牙面的黏附增殖和生物膜的形成，其致病能力也相应减弱[1-2,6-7]。因此，SrtA是影响变异链球菌黏附能力的重要毒力因子。

    以往研究中使用的srtA基因缺陷株多是采用插入突变和带标记的等位同源突变两种方法构建的，这两种技术中外源DNA片段的引入、明显的极性效应都可能影响研究结果的可信度[8-10]。框内缺失法是目前常用的构建无标记基因缺失株的方法之一[9-10]，利用IFDC2基因盒及等位同源交换技术可以高效快捷地完成框内缺失突变株的构建 ......