刘茜 李雪健 王忠山

    军事口腔医学国家重点实验室，口腔疾病国家临床医学研究中心，陕西省口腔医学重点实验室，空军军医大学口腔医院修复科，西安 710032

    在口腔颌面部创伤中，常见鼻、耳廓软骨或软骨下组织的缺损，其严重影响患者的面部健康、美观以及生活质量。软骨是一种无血管、淋巴、神经的组织，其中包含的软骨细胞属于终末分化细胞，自我修复与再生的能力非常有限[1]。

    近年来，运用脱细胞生物支架材料以及人间充质干细胞进行组织再生的研究越来越多。猪软骨脱细胞基质(porcine acellular cartilaginous matrix，pACM)是一种天然的生物支架材料，其消除了细胞和抗原成分，同时含有大量胶原及软骨细胞分泌的多种细胞因子，可以提供类似于天然软骨的微环境，从而有利于诱导干细胞向软骨分化[1-2]。人间充质干细胞具有较强的自我更新能力以及多向分化潜能，其中，人脂肪干细胞(human adipose-derived stromal cells，hADSCs)来源丰富，较易获取，且造成损伤较小[3]。本实验将pACM与hADSCs进行共培养，研究其对hADSCs增殖及分化的影响，从而在细胞水平探讨将pACM与hADSCs联合应用后进行软骨再生的可能性。

    1 材料和方法

    1.1 主要实验材料及仪器

    α-MEM培养基、胎牛血清(Hyclone公司，美国)，胰蛋白酶、双抗(上海碧云天生物技术有限公司)，十二烷基硫酸钠脱细胞液(sodium dodecyl sulfate，SDS)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX- 100)、DNA酶、RNA酶(Sigma公司，美国)，酶标仪(BioTek弓丝，美国)，蛋白定量试剂盒、蛋白质印迹(Western blot)发光液、细胞培养箱(Thermo Scientific公司，美国)，荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪(Bio-Rad公司，美国)，抗SOX-9、抗Ⅱ型胶原纤维α1(collagen type Ⅱ alpha 1 chain，COL2A1)、抗蛋白聚糖(aggrecan，ACAN)(Santa Cruz公司，美国)。

    1.2 pACM制备

    将猪关节软骨剪碎，在液氮中浸泡5 min，用高通量组织研磨仪将软骨碎块粉碎，PBS冲洗过滤，加入1%SDS脱细胞液，置于37 ℃摇床中4 h，PBS冲洗，加入1%TritonX-100液1 h破膜 ......