胡大强(第三军医大学第三附属医院药剂科，重庆市 400042)

    蛋白转导结构域修饰小鼠干扰素-γ的研制

    胡大强*(第三军医大学第三附属医院药剂科，重庆市 400042)

    目的：制备蛋白转导结构域修饰小鼠干扰素-γ(PTD-mIFN-γ)，为研究PTD-mIFN-γ功能作准备。方法：以质粒pUC19/ mIFN-γ为模板，经3轮聚合酶链反应(PCR)扩增编码PTD-mIFN-γ片段，克隆于质粒pUC19上，测序鉴定正确后构建到pQE80L表达质粒载体中，经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot法检测表达的目的蛋白，镍离子-次氨基三乙酸(Ni2+-NTA)凝胶亲和层析纯化重组蛋白，酶联免疫吸附实验(ELISA)检测PTD-mIFN-γ。结果：PCR扩增得到编码PTD-mIFN-γ的cDNA，SDS-PAGE和Western blot法分析显示重组蛋白获得了高效表达，ELISA法检测出目的蛋白。结论：成功制备了PTD-mIFN-γ。

    蛋白转导结构域；干扰素-γ；蛋白纯化；酶联免疫吸附实验

    干扰素-γ(Interferon gamma，INF-γ)具有抗病毒、抗肿瘤和调节免疫等作用[1]，临床已广泛使用。临床上人IFN-γ主要用于类风湿性关节炎、抗肝纤维化治疗。大量研究[2]显示IFN-γ对防治寻常疣和皮肤瘢痕增生是有益的，但常规肌肉注射或者静脉给药可降低患者依从性，如果能制备成乳膏，直接外用可能将增加其应用范围。然而，因为IFN-γ的分子量超过1万，皮肤对其吸收有屏蔽作用，从而限制了IFN-γ在寻常疣、皮肤疤痕增生外用给药的应用。蛋白转导结构域(Protein transduction domain，PTD)强大的跨膜递送功能的发现为克服上述方法中的不足提供了可能。本文选择PTD作为人Ⅰ型免疫缺陷病毒(HIV-Ⅰ)的反式激活因子(TAT)的11肽[3](氨基酸序列47～57，YGRKKRRQRRR)，采用基因工程技术，将PTD连接于小鼠IFN-γ(mIFN-γ)N端，为进一步研究PTD-mIFN-γ跨皮肤递送等功能提供基础。

    1 材料与方法

    1.1 质粒和菌株

    测序质粒pUC19、pUC19/mIFNγ，表达质粒pQE80L和DH5α菌株，均由第三军医大学第三附属医院药理室保存。

    1.2 试药与仪器

    Tripure RNA提取试剂(美国Roche公司)；限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ、DNA聚合酶、T4连接酶(大连宝生物公司)；质粒提取试剂盒、DNA片段胶回收和聚合酶链反应(PCR)产物回收试剂盒(美国Omega公司)；引物由上海生工公司合成；抗His单抗和镍离子-次氨基三乙酸(Ni2+-NTA)层析系统(德国Qiagen公司)；异丙基硫代半乳糖苷(IPTG ......