王微，郑飞，李霞，张炜煜(长春中医药大学，长春130117)

    哈蟆油为中国林蛙(Rana temporaria chensinensisDavid)雌蛙的干燥输卵管，又称“林蛙油”。该药是2010年版《中国药典》收载品种，具有补肾益精、养阴润肺之功效；用于治疗阴虚体弱、神疲乏力、心悸失眠、盗汗不止、痨嗽咳血[1]。有研究表明，蛋白质被水解成小分子的肽类或游离氨基酸后，更易被人体快速和多途径吸收[2～4]。蛋白质可用酶法或酸法水解分离出，但酶法水解蛋白质较酸法水解作用温和且条件容易控制。因此笔者对哈蟆油中有效部位，即蛋白质采用酶法进行提取，并通过药效学实验验证其免疫调节作用，为哈蟆油的临床应用提供理论基础。

    1 仪器与材料

    1.1 仪器

    JA5103N型电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；KQ2200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；pHS-25C型数字酸度剂(上海鹏顺科学仪器有限公司)；HHS21-Hi6电热恒温水浴锅(北京市长源实验设备厂)；DZF-6050型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)；E53042432型移液器(日本Nichirtyo公司)；WFH-203J型三用紫外-可见分析仪(上海精科实业有限公司)。

    1.2 试药

    哈蟆油为中国林蛙(中国林蛙购自吉林省桦甸市苏密沟林场，经长春中医药大学姜大成教授鉴定为真品)雌蛙蛙体干燥后剥取的输卵管，真空30℃烘干后，粉碎机粉碎，过100目筛，-5℃冰柜贮藏；环磷酰胺(浙江海正药业股份有限公司，批号：20100103)；木瓜蛋白酶(北京鼎国生物技术有限责任公司，批号：98010420)；氢氧化钠、硫酸铜、盐酸、硫酸钾、硫酸、甲醛均为分析纯。

    1.3 动物

    ICR小鼠140只，♀♂兼半，体重(20±2)g，购自吉林大学白求恩医学院实验动物中心(动物生产合格证号：0003217)。

    2 方法与结果

    2.1 酶解液水解度和收率的测定

    精密吸取酶解液5.0mL，置于锥形瓶中，加入20.0mL去二氧化碳蒸馏水，搅拌均匀，加入0.01mol·L-1NaOH标准溶液调节pH值至8.2，加入已中和好的甲醛溶液10mL，记录将其pH值调节至9.2时所耗0.01mol·L-1NaOH标准溶液的毫升数；以相同方法进行空白实验，记录毫升数。则水解液氨基氮为：水解液氨基氮(g·100g-1)＝(A-B)×N×V1×K×100/V(A：滴定水解液样品消耗NaOH标准溶液的体积(mL)；B：滴定空白样品消耗NaOH标准溶液的体积(mL)；N：滴定NaOH标准溶液的浓度(mol·L-1)；K：1mL 1mol·L-1NaOH标准溶液相当于氮的质量(g) ......