申茂磊 高存祥 郑丽英 王勤章 徐浩 郝志强 傅家豪 钱彪

    中图分类号 R361+.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408(2018)19-2607-05

    DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.19.04

    摘 要 目的：研究四环素对纳米细菌(NB)感染的人肾小管上皮细胞HK-2中钙敏感受体(CaSR)、紧密连接蛋白14(Claudin-14)表达的影響，为抑制肾结石的形成提供参考。方法：将HK-2细胞分为空白对照组、NB组和四环素组(NB+四环素)，每组3个复孔，各组分别加入相应NB和药物后共培养24 h。采用透射电子显微镜观察各组细胞的形态和超微结构变化，运用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和Western blot法分别检测细胞中CaSR、Claudin-14 mRNA和蛋白的表达水平。结果：与空白对照组比较，NB组细胞膜结构破损，胞核裸露在外，微绒毛基本消失，线粒体数量较少，结构肿胀，细胞中CaSR、Claudin-14 mRNA和蛋白表达水平明显升高(P95%)；DMEM培养基、1640培养基(美国Gibco公司，批号：10569010、22400071)；磷酸盐缓冲液(PBS)和胎牛血清(美国Hyclong公司，批号：SH30256.01、SH30084.03)；兔抗β-肌动蛋白(β-actin)抗体、兔抗Claudin-14抗体、小鼠抗CaSR抗体(美国Abcam公司，批号：ab8227、ab19035、ab19347)；抗兔辣根过氧化物酶、抗小鼠辣根过氧化物酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(北京中衫金桥有限公司，批号：2B-2301、2B-2305、TA-08)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司，批号：P0009)；化学发光(ECL)液(德国Merck-Millipore公司，批号：WBULS0100)；Trizol试剂(美国Life-Invitrogen公司，批号：15596026)；反转录试剂盒、荧光定量试剂盒(日本TaKaRa公司，批号：RR037A、RR820L)；引物均由上海生工生物公司设计合成；其余试剂均为分析纯。

    1.3 细胞

    人肾小管上皮细胞HK-2购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。

    2 方法

    2.1 NB的培养

    参照褚浩等[11]的方法进行操作。收集新疆石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科临床确诊肾结石且未应用药物或手术治疗患者的尿液，将尿液依次经过0.45、0.22 μm一次性正压滤器过滤 ......