桑椹花青素-3-葡萄糖苷对癫痫模型小鼠的保护作用及海马BDNF/TrkB通路的影响(1)
中图分类号 R285
文献标志码A
文章编号 1001-0408( 2020)03-0335-05
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.03.16
摘要 目的：研究桑椹花青素-3-葡萄糖苷对癫痫模型小鼠的保护作用及海马脑源性神经营养因子(BDNF)/酪氨酸激酶受体B(TrkB)通路的影响。方法：将120只C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组、单药(桑椹花青素-3-葡萄糖苷)和激动剂联用组(桑椹花青素-3-葡萄糖苷+TrkB激动剂LM22B-10)，每组30只。单药组和激动剂联用组小鼠每天灌胃600μg/kg桑椹花青素-3-葡萄糖苷1次、连续给药6周，激动剂联用组小鼠在给药第6周时每天侧脑室注入LM22B-10(5mg/kg)l次;正常组和模型组小鼠灌胃等体积生理盐水。末次给药后，除正常组外，其余各组小鼠均采用氯化锂一匹罗卡品建立癫痫模型。造模成功后，各组分别取10只小鼠记录其癫痫自发性再发作的潜伏期、发作频率及持续时间，每天观察6h，连续观察4周;并于造模第14、28、36天记录其脑电图，统计1h内脑电波异常发生次数。于造模后第6天，各组分别取10只小鼠检测其血清钙离子水平，并取各组剩余10只小鼠检测其海马组织中BDNF mRNA及蛋白表达。结果：与正常组比较，模型组小鼠癫痫自发性再发作的潜伏期、发作频率、持续时间及造模第14、28、36天脑电波异常发生次数均显著增加(P<0.05)，血清钙离子水平及海马BDNF mRNA、蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05)。与模型组比较，单药组小鼠癫痫自发性再发作行为的潜伏期、发作频率、持续时间及造模第28、36天脑电波异常发生次数均显著减少(P<0.05)，血清钙离子水平及海马BDNF mRNA、蛋白相对表达量均显著降低(P<0.05);与单药组比较，激动剂联用组小鼠癫痫自发性再发作的潜伏期、发作频率、持续时间及造模第28、36天脑电波异常发生次数均显著增加(P<0.05)，血清钙离子水平及海马BDNF mRNA、蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05)。结论：桑椹花青素-3一葡萄糖苷对癫痫模型心鼠具有一定的保护作用，其机制可能与抑制海马BDNF/TrkB通路的激活有关。
关键词 桑椹花青素-3-葡萄糖苷;癫痫;脑源性神经营养因子;酪氨酸激酶受体B;机制;小鼠
癫痫为儿科常见病，是由于脑神经元反复异常放电所致，临床上多表现为惊厥、阵挛或窒息发作，对患儿的生活质量造成了较大影响，严重者可危及生命[1-2]。目前，癫痫主要通过药物进行治疗，常用的药物有丙戊酸钠、奥卡西平等[3]。虽然目前临床可使用的抗癫痫药物较多，但其治疗效果却不尽如人意，且药物治疗引起的副作用给患儿及其家属带来了不少困扰[4]。癫痫的发病机制较复杂，尚未完全阐明。据报道，脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)/酪氨酸激酶受体B(Tyrosine kinase B.TrkB)通路与癫痫的发病具有一定的相关性[5]。
花青素是自然界中一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，目前用于提取花青素的主要原料有藍莓、桑椹、玉米等[6]。桑椹为桑科植物桑树(Morus alba Linn.)的成熟果穗，具有抗氧化、降血糖、抗衰老等多种生物活性，是常见的药食同源的作物之一，从桑椹中提取的花青素具有含量高、性质较稳定、受光照和温度影响较小等优点，其主要成分为花青素-3-葡萄糖苷[7]。研究发现，花青素对癫痫模型小鼠细胞凋亡具有抑制作用[6];花青素-3-葡萄糖苷也具有抗氧化、清除自由基、抗炎和抗肿瘤等作用[8]。作为花青素中主要成分，关于其是否具有抗癫痫作用以及其作用机制的报道较少。鉴于此，本研究以桑椹花青素中主要成分花青素-3-葡萄糖苷为研究对象，考察其对癫痫模型小鼠的保护作用，并基于BDNF/TrkB通路考察其作用机制，为该化合物的开发利用提供实验参考。
l 材料
1.1 仪器
LC1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);J2-21M型高速低温离心机、Mc pr0 384型实时荧光定量-聚合酶链式反应(PCR)仪(德国Eppendorf公司);GE AI600型超灵敏多功能生物分子成像仪(美国Amer-sham Imager公司);B-H-300A型动物行为学研究试验仪(北京北广精仪仪器有限公司)。
1.2 药品与试剂
桑椹购自河北农沃绿农业科技有限公司(批号：180213)，由四川农业大学园艺学院赖云松副研究员鉴定为桑科植物桑树(M.alba Linn.)的成熟果穗;TrkB激动剂LM22B-10(美国Selleck公司，货号：6037，纯度：98.81%);氯化锂(上海晶抗生物工程有限公司，货号：7447-41-8);氢溴酸东莨菪碱注射液(上海禾丰制药有限公司，批号：H31021519，规格：0.3g/mL);盐酸匹罗卡品(货号：CAT 54-71-7，规格：200g)、甲基百里香酚蓝(MTB)比色法试剂盒(货号：CAT 1945-77-3)均购自美国Sigma公司;兔源BDNF抗体(货号：ab108389)、鼠源甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(货号：ab22555)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)二抗(货号：ab97051)、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(货号：ab6789)均购自英国Abcam公司;RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司，批号：15589218);引物均由北京擎科生物有限公司合成;其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
1.3 动物
C57BL/6小鼠120只，雄性，体质量25～30g，由河北医科大学动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK(冀)2014-0198。小鼠饲养环境通风良好，光照周期为12h，环境温度为25℃，湿度为50%，饲养期间自由摄食、饮水。, http://www.100md.com(王芳 侯自立 韩冰 解国圣 张艳玲)
文献标志码A
文章编号 1001-0408( 2020)03-0335-05
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.03.16
摘要 目的：研究桑椹花青素-3-葡萄糖苷对癫痫模型小鼠的保护作用及海马脑源性神经营养因子(BDNF)/酪氨酸激酶受体B(TrkB)通路的影响。方法：将120只C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组、单药(桑椹花青素-3-葡萄糖苷)和激动剂联用组(桑椹花青素-3-葡萄糖苷+TrkB激动剂LM22B-10)，每组30只。单药组和激动剂联用组小鼠每天灌胃600μg/kg桑椹花青素-3-葡萄糖苷1次、连续给药6周，激动剂联用组小鼠在给药第6周时每天侧脑室注入LM22B-10(5mg/kg)l次;正常组和模型组小鼠灌胃等体积生理盐水。末次给药后，除正常组外，其余各组小鼠均采用氯化锂一匹罗卡品建立癫痫模型。造模成功后，各组分别取10只小鼠记录其癫痫自发性再发作的潜伏期、发作频率及持续时间，每天观察6h，连续观察4周;并于造模第14、28、36天记录其脑电图，统计1h内脑电波异常发生次数。于造模后第6天，各组分别取10只小鼠检测其血清钙离子水平，并取各组剩余10只小鼠检测其海马组织中BDNF mRNA及蛋白表达。结果：与正常组比较，模型组小鼠癫痫自发性再发作的潜伏期、发作频率、持续时间及造模第14、28、36天脑电波异常发生次数均显著增加(P<0.05)，血清钙离子水平及海马BDNF mRNA、蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05)。与模型组比较，单药组小鼠癫痫自发性再发作行为的潜伏期、发作频率、持续时间及造模第28、36天脑电波异常发生次数均显著减少(P<0.05)，血清钙离子水平及海马BDNF mRNA、蛋白相对表达量均显著降低(P<0.05);与单药组比较，激动剂联用组小鼠癫痫自发性再发作的潜伏期、发作频率、持续时间及造模第28、36天脑电波异常发生次数均显著增加(P<0.05)，血清钙离子水平及海马BDNF mRNA、蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05)。结论：桑椹花青素-3一葡萄糖苷对癫痫模型心鼠具有一定的保护作用，其机制可能与抑制海马BDNF/TrkB通路的激活有关。
关键词 桑椹花青素-3-葡萄糖苷;癫痫;脑源性神经营养因子;酪氨酸激酶受体B;机制;小鼠
癫痫为儿科常见病，是由于脑神经元反复异常放电所致，临床上多表现为惊厥、阵挛或窒息发作，对患儿的生活质量造成了较大影响，严重者可危及生命[1-2]。目前，癫痫主要通过药物进行治疗，常用的药物有丙戊酸钠、奥卡西平等[3]。虽然目前临床可使用的抗癫痫药物较多，但其治疗效果却不尽如人意，且药物治疗引起的副作用给患儿及其家属带来了不少困扰[4]。癫痫的发病机制较复杂，尚未完全阐明。据报道，脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)/酪氨酸激酶受体B(Tyrosine kinase B.TrkB)通路与癫痫的发病具有一定的相关性[5]。
花青素是自然界中一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，目前用于提取花青素的主要原料有藍莓、桑椹、玉米等[6]。桑椹为桑科植物桑树(Morus alba Linn.)的成熟果穗，具有抗氧化、降血糖、抗衰老等多种生物活性，是常见的药食同源的作物之一，从桑椹中提取的花青素具有含量高、性质较稳定、受光照和温度影响较小等优点，其主要成分为花青素-3-葡萄糖苷[7]。研究发现，花青素对癫痫模型小鼠细胞凋亡具有抑制作用[6];花青素-3-葡萄糖苷也具有抗氧化、清除自由基、抗炎和抗肿瘤等作用[8]。作为花青素中主要成分，关于其是否具有抗癫痫作用以及其作用机制的报道较少。鉴于此，本研究以桑椹花青素中主要成分花青素-3-葡萄糖苷为研究对象，考察其对癫痫模型小鼠的保护作用，并基于BDNF/TrkB通路考察其作用机制，为该化合物的开发利用提供实验参考。
l 材料
1.1 仪器
LC1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);J2-21M型高速低温离心机、Mc pr0 384型实时荧光定量-聚合酶链式反应(PCR)仪(德国Eppendorf公司);GE AI600型超灵敏多功能生物分子成像仪(美国Amer-sham Imager公司);B-H-300A型动物行为学研究试验仪(北京北广精仪仪器有限公司)。
1.2 药品与试剂
桑椹购自河北农沃绿农业科技有限公司(批号：180213)，由四川农业大学园艺学院赖云松副研究员鉴定为桑科植物桑树(M.alba Linn.)的成熟果穗;TrkB激动剂LM22B-10(美国Selleck公司，货号：6037，纯度：98.81%);氯化锂(上海晶抗生物工程有限公司，货号：7447-41-8);氢溴酸东莨菪碱注射液(上海禾丰制药有限公司，批号：H31021519，规格：0.3g/mL);盐酸匹罗卡品(货号：CAT 54-71-7，规格：200g)、甲基百里香酚蓝(MTB)比色法试剂盒(货号：CAT 1945-77-3)均购自美国Sigma公司;兔源BDNF抗体(货号：ab108389)、鼠源甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(货号：ab22555)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)二抗(货号：ab97051)、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(货号：ab6789)均购自英国Abcam公司;RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司，批号：15589218);引物均由北京擎科生物有限公司合成;其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
1.3 动物
C57BL/6小鼠120只，雄性，体质量25～30g，由河北医科大学动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK(冀)2014-0198。小鼠饲养环境通风良好，光照周期为12h，环境温度为25℃，湿度为50%，饲养期间自由摄食、饮水。, http://www.100md.com(王芳 侯自立 韩冰 解国圣 张艳玲)
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