左旋紫草素对顺铂耐药人宫颈癌HeLa细胞的逆转作用研究(4)
采用Western blotting法检测。取“2.2”项下对数生长期的HeLa/DDP细胞适量,以5 000个/孔接种于12孔培养板中,培养24 h后,按“2.5”项下方法分组、给药,每组设3个复孔。培养48 h后,加入RIPA细胞裂解液100 μL,充分混匀,冰浴30 min,于4 ℃下以12 000 r/min离心20 min,收集上清液,以DC法测定蛋白含量。蛋白经上样缓冲液稀释后,于100 ℃下变性5 min。取变性后的蛋白样品适量,行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(电压:80~180 V);电泳后,于80 V下转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上;以5%脱脂奶粉封闭1 h后,分别加入相应一抗(稀释度均为1 ∶ 1 000),4 ℃孵育过夜;用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(TBST)溶液清洗5 min×3次,加入相应二抗(稀释度为1 ∶ 5 000),室温孵育1 h;用TBST溶液清洗5 min×3次,以ECL发光液显色处理后,置于凝胶成像仪上成像并采用Image J v1.7.0软件分析,以相应蛋白与内参β-actin的灰度值比值表示该蛋白的表达量 ......
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