张晓丹 李文娣 张茹 盛洁静 张佳男 刘慧宇 李松林

    摘 要 目的：探討葛根素(Pue)对缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)焦亡的影响及其调控机制。方法：以大鼠PASMCs为对象，将其随机分为常氧组、缺氧组和缺氧+Pue组(0.2 mmol/L)，除常氧组外，其余各组均于37 ℃、5%CO2、3%O2条件下培养24 h以建立缺氧模型。采用Western blot法检测细胞中焦亡相关蛋白[NOD样受体蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶1、白细胞介素1β、凋亡相关斑点样蛋白]的表达水平;采用乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测细胞中LDH的释放量;采用Hoechst 33342/PI双染色法检测焦亡阳性细胞比例。另将PASMCs随机分为常氧+对照质粒组、缺氧+对照质粒组、缺氧+过表达质粒组和缺氧+过表达质粒+Pue组，除常氧+对照质粒组外，其余各组均同法建立缺氧模型;在分别转染对照质粒或NLRP3过表达质粒后，采用Western blot法、LDH释放实验和Hoechst 33342/PI双染色法检测Pue是否通过干扰NLRP3炎症小体来发挥对缺氧致PASMCs焦亡的影响。结果：与常氧组比较，缺氧组细胞中焦亡相关蛋白的表达水平、LDH释放量和焦亡阳性细胞比例均显著升高(P98%)购自大连美仑生物技术有限公司，以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂配制成200 mmol/L的无菌溶液进行实验，现用现配。

    DMEM培养液(批号AF29498408)购自美国HyClone公司;胎牛血清(批号FB25015)购自美国Clark Bioscience公司;胰酶消化液、青-链霉素双抗、RIPA细胞裂解液、Hoechst 33342/PI双染检测试剂盒(批号C0201、C0222、P0013B、C1056)均购自上海碧云天生物技术有限公司;兔抗大鼠ASC多克隆抗体、兔抗大鼠caspase-1多克隆抗体(批号分别为PA5-85810、PA5-87536)均购自美国CST公司;兔抗大鼠NLRP3单克隆抗体、小鼠抗大鼠β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体(批号分别为ab263899、ab8226)均购自英国Abcam公司;兔抗大鼠IL-1β多克隆抗体(批号bs-20448R)购自北京博奥森生物技术有限公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗、HRP标记的山羊抗大鼠IgG二抗(批号分别为E030120、E030110)均购自美国EarthOx LLC公司;对照质粒、NLRP3过表达质粒(批号均为00043118)均购自上海吉凯基因科技有限公司;乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒、ECL超敏化学发光液(批号分别为MAK066、WBULS0100)均购自美国Sigma-Aldrich公司;X-treme转染载体(批号65453)购自瑞士Roche公司;BCA蛋白定量试剂盒(批号23227)购自美国Thermo Fisher Scientific公司;脱脂奶粉、DMSO(批号分别为1172、1084)购自德国Biofroxx公司;其余试剂为分析纯或实验室常用规格 ......