柳晓蕊 ，许智朝 ，王兆涛 ，张媚媚 ，简晓顺 ，彭怀东 (.广州医科大学附属肿瘤医院药学部，广州 50095；.广州医科大学附属第二医院神经外科，广州 5060；.广州医科大学附属第二医院药学部，广州 5060)

    脑出血是指非外伤导致的脑实质内血管破裂出血，具有高发病率、高致残率和高病死率等特点[1]。在脑出血的急性期，过度的炎症反应会导致小胶质细胞过度活化，进而产生大量毒性促炎因子，破坏血脑屏障并加剧脑水肿，最终导致神经元凋亡[2—3]。因此，抑制脑出血后急性期过度的炎症反应可能是治疗脑出血的有效途径[4]。脑出血后的炎症损伤机制十分复杂，涉及多个分子和信号通路。其中，Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)是一种保守的天然免疫受体，在脑出血后的炎症反应中具有重要作用，其表达下调与抑制脑出血后炎症反应有关，是治疗脑出血的有效手段[5—6]。毛蕊异黄酮(calycosin，CA)是从中药材黄芪中提取的黄酮类成分，具有抗炎、抗氧化作用，对受损脑组织具有保护的作用[7—8]。基于此，本研究通过构建脑出血小鼠模型，初步探讨CA 对脑出血的改善作用，并通过体外培养原代小胶质细胞和原代神经元进一步探讨该成分是否能通过抑制TLR4 表达而减轻脑出血后继发的急性炎症损伤，为进一步开发CA用于临床治疗脑出血提供实验基础。

    1 材料

    1.1 主要仪器

    68025型脑立体定位仪购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；2406-2 型细胞CO2培养箱购自美国Thermo Fisher Scientific公司；LX71型荧光倒置显微镜购自日本Olympus 公司；LB 942 型多功能酶标仪购自德国Berthold Technologies 公司；Transwell 板(12 孔，孔径0.4 μm)购自美国Corning公司；ChemiScope 6100型荧光及化学发光成像系统购自上海勤翔科学仪器有限公司。

    1.2 主要药品与试剂

    CA 对照品(货号WXHY-000687，纯度>98%)购自天津万象恒远科技有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS)、牛血清白蛋白(BSA)、Ⅶ型胶原酶(货号分别为E607008、A600332、A005332)均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；DMEM 高糖培养基、胎牛血清(FBS)、B27 添加剂、Neurobasal培养基(货号分别为11995040、10099141、17504044、21103049)均购自美国Gibco 公司；一步法TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒、Triton X-100 试剂、鼠源β-actin 单克隆抗体、红细胞(RBC)裂解液(货号分别为C1088、P0096、AA128、C3702)均购自上海碧云天生物技术有限公司；ACCUTASE 细胞消化液、多聚甲醛(货号分别为A6964、P6148)均购自美国Sigma公司；兔源离子钙结合衔接分子1(ionized calcium-binding adaptor molecule 1 ......