木香、川木香、土木香、青木香和红木香药材的ITS2条形码分子鉴定(2)
2 方法木香、川木香、土木香和马兜铃的干燥根均用75%乙醇擦拭药材表面后,刮去外表皮,取根的内部约45 mg,用DNA 提取研磨仪 (Retsch MM400,Germany) 研磨2 min(30 次/s) 后,水浴56 ℃8~12 h。利用植物基因组DNA提取试剂盒 (Tiangen Biotech Co.,China) 提取总DNA。提取过程中,氯仿-异戊醇(24∶1)抽提2次,沉淀DNA步骤时,用-20 ℃预冷的异丙醇沉淀DNA ,摇匀,放入-20 ℃冰箱冷冻30 min,用50 μL水洗脱。叶片的DNA提取方法完全按照Chen等[25]研究的方法。PCR 扩增、测序引物正向ITS2F为5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′,反向ITS3R为5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′ [25]。 PCR 反应体积为25 μL,体系内包含PCRmix 12.5 μL,2.5 μmol·L-1引物各1 μL,模板DNA 约 20~100 ng。扩增程序: 94 ℃变性5 min;再进行40个循环 (94 ℃变性30 s ......
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