基于SRAP和SNP分子标记的国内穿心莲遗传多样性分析(1)
[摘要] 为了阐明国产穿心莲的遗传多样性以及探讨遗传背景对穿心莲药材质量的影响，利用110对SRAP引物和1对SNP特异性引物，对我国7个省份13个样地的103份穿心莲样品进行遗传多样性分析。采用Powermarker V3.25和Mega 6.0软件分析群体的遗传结构，CodonCode Aligner软件分析功能基因单核苷酸多态性变异。聚类分析结果表明各穿心莲样品的遗传距离范围为0.01～0.09，CPS基因片段中未检测到SNP位点，国产各地穿心莲种质间遗传多样性较贫乏，这与穿心莲严格的自花授粉繁殖特性、我国各地引种穿心莲种源来源单一密切相关。遗传背景并非影响各地穿心莲质量差异的主要原因，穿心莲的良种选育以采用突变育种、多倍体育种和分子育种等方法为宜。
[关键词] 穿心莲;SRAP分子标记;SNP分子标记;遗传多样性
穿心莲为常用中药，来源于爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees，以地上部分入药，具有保肝利胆、抗肿瘤、抗氧化、清热解毒、抗菌消炎、消肿止痛等多种作用，临床常用于中止妊娠，治疗疟疾、毒蛇咬伤、糖尿病和高血压等心血管疾病[1]。穿心莲主要含有二萜内酯类化合物，有广谱抗菌和抗病毒作用，有“天然抗生素”之称。据印度1885年的史料记载，穿心莲原产于印度半岛和斯里兰卡[2-5]，在东南亚国家以及我国广为引种栽培[6-7]。由于大量采挖导致野生资源急剧减少，已被列为印度国家保护物种。作为重要的药用资源，自2001年，斯里兰卡规定禁止穿心莲的出口[8]。之后，印度、马来西亚等国家也纷纷对穿心莲种质资源实行了保护[1，9-10]。我国引种栽培穿心莲的确切时间已无法考证，但穿心莲作为中药首见《岭南采药录》(1932年)以“春莲秋柳”之名记载[11]，至少应有80年以上历史。穿心莲目前主产于两广和福建，但北至陕西、长江南北各地多有引种栽培。有研究报道全国不同产地穿心莲的主要活性成分差异较大，药材质量参差不齐[12-14]，这种品质差异可能受到种质遗传背景、产地生态、栽培技术及采收时期等多方面因素的影响，同时也对穿心莲的良种选育提出了需求。
, 百拇医药
SRAP(sequence-related amplified polymorphism，相关序列扩增多态性)分子标记是分析植物材料遗传背景的有力工具。SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)分子标记用于研究基因功能具有重要意义。穿心莲内酯是穿心莲的主要活性成分，在其生物合成中的一个关键步骤是焦磷酸香叶基香叶酯(GGPP)环合形成ent-焦磷酸古巴酯(ent-CPP)，从而形成穿心莲内酯的母核结构，而催化这个环合反应的二萜合酶——ent-柯巴基焦磷酸合酶(ent-copalyl diphosphate synthase，CPS)，是影响穿心莲内酯生物合成的关键限速酶。有学者利用SSCP技术，在泰国分布的穿心莲中，检测到CPS基因内部存在1个SNP位点[15]。本研究利用SRAP和SNP分子标记研究我国穿心莲不同种群的遗传结构和亲缘关系，以探索各地穿心莲质量差异的遗传背景，探究国内穿心莲种群的进化潜力，为其种质资源保护和良种选育提供科学参考。
1 材料
, 百拇医药
SRAP分析的103份样品采自7个省份13个采样地(均为栽培地采样)，采集单株的新鲜叶片，立即装于自封袋，并加入硅胶干燥剂保存备用。
从13个采样点中，各随机选取2份共计26份用于SNP分析(其中64号样品仅采集1份，故用同时采集的种子育苗取叶，补充1份)。
所有样品经江西中医药大学曹岚副教授鉴定为爵床科植物穿心莲A. paniculata，凭证标本存于江西中医药大学民族传统药现代科技与产业发展协同创新中心标本室(表1)。
表1 材料来源
Table 1 Origin of Andrographis paniculata
No.采集地
1～9广西横县校椅镇校椅村
, 百拇医药
10～18广西贵港桥圩镇白屋村
19～27广西隆安屏山
28～36四川宜宾南溪裴石乡
37～45四川宜宾南溪江南
46～54安徽潭棚
55～63安徽牛庄
64海南洋浦开发区咸塘社区千年古盐田
65～73福建龙海隆教乡
74～82福建漳浦赤湖镇前张村
83～91广东湛江市遂溪县北坡镇冠粤中草药种植合作社
, 百拇医药 92～100广东湛江雷州市客路镇林排村
101～103云南景洪南药园(逸野)
2×Taq PCR MasterMix，10×Ex Taq Buffer，TaKaRa Ex Taq，dNTP Mixture，DNA Marker DL2000均购自天根生化科技(北京)有限公司，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。电泳试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。利用Bio-Rad MJ PTC-200型PCR仪进行扩增，北京六一厂生产的垂直胶电泳系统进行PAGE胶的制备与电泳。
2 方法
2.1 基因组DNA的提取 利用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒(DP305-02)提取基因组DNA。
2.2 SRAP扩增体系和程序 SRAP分子标记扩增所用引物共110对[16]。PCR扩增体系为10 μL，包括2×Taq Master Mix 5 μL，上、下游引物各0.2 μL，DNA模板2 μL，加水补足到10 μL，。PCR扩增程序为：94 ℃ 3 min;94 ℃ 1 min，37 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，循环5次;94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，循环35次;72 ℃ 5 min。, 百拇医药(陈蓉 王晓云 宋毓宁 朱云峰 王鹏良 李敏 钟国跃)
[关键词] 穿心莲;SRAP分子标记;SNP分子标记;遗传多样性
穿心莲为常用中药，来源于爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees，以地上部分入药，具有保肝利胆、抗肿瘤、抗氧化、清热解毒、抗菌消炎、消肿止痛等多种作用，临床常用于中止妊娠，治疗疟疾、毒蛇咬伤、糖尿病和高血压等心血管疾病[1]。穿心莲主要含有二萜内酯类化合物，有广谱抗菌和抗病毒作用，有“天然抗生素”之称。据印度1885年的史料记载，穿心莲原产于印度半岛和斯里兰卡[2-5]，在东南亚国家以及我国广为引种栽培[6-7]。由于大量采挖导致野生资源急剧减少，已被列为印度国家保护物种。作为重要的药用资源，自2001年，斯里兰卡规定禁止穿心莲的出口[8]。之后，印度、马来西亚等国家也纷纷对穿心莲种质资源实行了保护[1，9-10]。我国引种栽培穿心莲的确切时间已无法考证，但穿心莲作为中药首见《岭南采药录》(1932年)以“春莲秋柳”之名记载[11]，至少应有80年以上历史。穿心莲目前主产于两广和福建，但北至陕西、长江南北各地多有引种栽培。有研究报道全国不同产地穿心莲的主要活性成分差异较大，药材质量参差不齐[12-14]，这种品质差异可能受到种质遗传背景、产地生态、栽培技术及采收时期等多方面因素的影响，同时也对穿心莲的良种选育提出了需求。
, 百拇医药
SRAP(sequence-related amplified polymorphism，相关序列扩增多态性)分子标记是分析植物材料遗传背景的有力工具。SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)分子标记用于研究基因功能具有重要意义。穿心莲内酯是穿心莲的主要活性成分，在其生物合成中的一个关键步骤是焦磷酸香叶基香叶酯(GGPP)环合形成ent-焦磷酸古巴酯(ent-CPP)，从而形成穿心莲内酯的母核结构，而催化这个环合反应的二萜合酶——ent-柯巴基焦磷酸合酶(ent-copalyl diphosphate synthase，CPS)，是影响穿心莲内酯生物合成的关键限速酶。有学者利用SSCP技术，在泰国分布的穿心莲中，检测到CPS基因内部存在1个SNP位点[15]。本研究利用SRAP和SNP分子标记研究我国穿心莲不同种群的遗传结构和亲缘关系，以探索各地穿心莲质量差异的遗传背景，探究国内穿心莲种群的进化潜力，为其种质资源保护和良种选育提供科学参考。
1 材料
, 百拇医药
SRAP分析的103份样品采自7个省份13个采样地(均为栽培地采样)，采集单株的新鲜叶片，立即装于自封袋，并加入硅胶干燥剂保存备用。
从13个采样点中，各随机选取2份共计26份用于SNP分析(其中64号样品仅采集1份，故用同时采集的种子育苗取叶，补充1份)。
所有样品经江西中医药大学曹岚副教授鉴定为爵床科植物穿心莲A. paniculata，凭证标本存于江西中医药大学民族传统药现代科技与产业发展协同创新中心标本室(表1)。
表1 材料来源
Table 1 Origin of Andrographis paniculata
No.采集地
1～9广西横县校椅镇校椅村
, 百拇医药
10～18广西贵港桥圩镇白屋村
19～27广西隆安屏山
28～36四川宜宾南溪裴石乡
37～45四川宜宾南溪江南
46～54安徽潭棚
55～63安徽牛庄
64海南洋浦开发区咸塘社区千年古盐田
65～73福建龙海隆教乡
74～82福建漳浦赤湖镇前张村
83～91广东湛江市遂溪县北坡镇冠粤中草药种植合作社
, 百拇医药 92～100广东湛江雷州市客路镇林排村
101～103云南景洪南药园(逸野)
2×Taq PCR MasterMix，10×Ex Taq Buffer，TaKaRa Ex Taq，dNTP Mixture，DNA Marker DL2000均购自天根生化科技(北京)有限公司，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。电泳试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。利用Bio-Rad MJ PTC-200型PCR仪进行扩增，北京六一厂生产的垂直胶电泳系统进行PAGE胶的制备与电泳。
2 方法
2.1 基因组DNA的提取 利用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒(DP305-02)提取基因组DNA。
2.2 SRAP扩增体系和程序 SRAP分子标记扩增所用引物共110对[16]。PCR扩增体系为10 μL，包括2×Taq Master Mix 5 μL，上、下游引物各0.2 μL，DNA模板2 μL，加水补足到10 μL，。PCR扩增程序为：94 ℃ 3 min;94 ℃ 1 min，37 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，循环5次;94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，循环35次;72 ℃ 5 min。, 百拇医药(陈蓉 王晓云 宋毓宁 朱云峰 王鹏良 李敏 钟国跃)