鸡血藤醇提物及其活性成分儿茶素抗辐射作用及机制研究(3)
27流式细胞术检测骨髓细胞凋亡
方法同上制得骨髓单个核细胞。每组取5×105细胞，用PBS洗涤2次(2 000 r·min-1离心5 min)，加入500 μL Binding Buffer悬浮细胞，加5 μL Annexin VFITC混匀后，再加5 μL PI，混匀，室温避光反应15 min，在1 h内上机检测。
28Western blot法检测cleaved caspase3的表达
将27项中每组剩余的骨髓单个核细胞用PBS洗涤2次，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂充分裂解，4 ℃，12 000 r·min-1离心30 min。取上清，BCA试剂盒蛋白定量，细胞总蛋白加上样缓冲液煮沸变性。用10% SDSPAGE分离蛋白，转膜后用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温杂交2 h，洗膜后，加入ECL发光液，进行检测。
29免疫组化法检测Bax的表达
将25项中小鼠股骨骨髓蜡块切片，烘干，逐步脱蜡和水化，而后进行抗原修复，滴加山羊血清于37 ℃温箱中封闭20 min。取出切片加一抗Bax，4 ℃冰箱孵育过夜，再加入二抗37 ℃温箱孵育30 min ......
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方法同上制得骨髓单个核细胞。每组取5×105细胞，用PBS洗涤2次(2 000 r·min-1离心5 min)，加入500 μL Binding Buffer悬浮细胞，加5 μL Annexin VFITC混匀后，再加5 μL PI，混匀，室温避光反应15 min，在1 h内上机检测。
28Western blot法检测cleaved caspase3的表达
将27项中每组剩余的骨髓单个核细胞用PBS洗涤2次，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂充分裂解，4 ℃，12 000 r·min-1离心30 min。取上清，BCA试剂盒蛋白定量，细胞总蛋白加上样缓冲液煮沸变性。用10% SDSPAGE分离蛋白，转膜后用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温杂交2 h，洗膜后，加入ECL发光液，进行检测。
29免疫组化法检测Bax的表达
将25项中小鼠股骨骨髓蜡块切片，烘干，逐步脱蜡和水化，而后进行抗原修复，滴加山羊血清于37 ℃温箱中封闭20 min。取出切片加一抗Bax，4 ℃冰箱孵育过夜，再加入二抗37 ℃温箱孵育30 min ......
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