甘草炮制雷公藤降低其肝毒性作用的初步研究(1)
[摘要]为探讨甘草炮制雷公藤降低其肝毒性的作用，动物实验评价炮制前后雷公藤对肝脏的毒性，观察空白组、雷公藤组、甘草炮制雷公藤组肝组织病理切片、血清生化指标及细胞炎症因子的差异。大鼠肝组织病理切片显示雷公藤组肝组织损伤明显，炮制后肝组织未见明显损伤；雷公藤组与空白组比较AST，ALT，CRE升高(P<001)，UREA升高(P<005)，ALB降低(P<001)；甘草炮制雷公藤组与雷公藤组比较AST，ALT，CRE，UREA降低(P<001)，ALB升高(P<001)。炎症因子检测结果显示雷公藤组与空白组比较IL1β， IL6，TNFα显著升高(P<001)；甘草炮制雷公藤组与雷公藤组比较IL1β， IL6，TNFα显著降低(P<001)。甘草炮制雷公藤可有效降低雷公藤肝毒性，减轻雷公藤导致的肝损伤。该实验可为雷公藤合理制用提供参考，同时为甘草炮制雷公藤降低其肝毒性研究提供数据支持。
[关键词]雷公藤； 甘草； 炮制减毒； 肝毒性； 炎症因子
雷公藤Tripterygium wilfordii Hook F为卫矛科雷公藤属一年生藤本植物，最早记载于《神农本草经》，味苦、辛，性寒，有大毒，归肝、肾经。具有祛风除湿、舒筋活络、消肿止痛、杀虫解毒等功效。在临床上治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、红斑狼疮、肾病综合征等自身免疫系统疑难病症有良好的效果，疗效独特[12]，但由于雷公藤毒性较大，临床应用时不良反应时有发生，包括肾脏、生殖系统、肝脏、胃肠道、免疫系统及皮肤黏膜等，其中肝脏为其最常见的受累器官之一[34]，已严重制约其临床应用。
, http://www.100md.com
历代文献对雷公藤炮制减毒方法的记载甚少，现代对其炮制的研究方法有净制、蒸制、加辅料(羊血)、灵芝双向发酵解毒等[57]，目前临床应用时，主要是对雷公藤进行净制，取毒性较小的木质部作为药用，但中毒及不良反应现象仍很突出。雷公藤加热炮制和辅料炮制减毒的现代研究也较少，且减毒效果不明显。现代研究表明，甘草具有保肝作用，甘草酸是其主要作用成分[8]。文献记载甘草常用于有毒中药的配伍及炮制[8]，甘草汁炮制是传统减消中药毒性的手段，有文献报道甘草配伍雷公藤能显著降低肝毒性，且已优化了最佳配伍比例，从化学角度证实了雷公藤配伍甘草对毒性成分含量和比例的影响[911]。为此，本研究以肝毒性中药雷公藤为研究对象，在甘草配伍雷公藤减毒的实验研究和临床应用基础上，拟结合现代研究成果，研究甘草炮制雷公藤减毒的作用及效果，以期为临床提供安全、有效、便于使用的雷公藤炮制品，同时为其他肝毒性中药研究提供参考和数据支持。
1材料
旋转蒸发仪(RE52AA)；水循环真空泵(上海知信实验仪器技术有限公司)；AL204电子天平(METTLER TOLEDO)；Gradient A10 MillQ超纯水器(美国Millipore 公司)；超声提取清洗器(KQ5200E)；真空冷冻干燥箱；OLYMPUS光学显微镜；冷冻离心机(Sigma，德国)；低速离心机(SE3614)；自动生化仪(mindray BS300)；酶标仪；水浴锅(AISITE)；电磁炉。
, 百拇医药
雷公藤T wilfordii生药材购自福建三明，经首都医科大学附属北京友谊医院赵奎君教授鉴定，为卫矛科雷公藤的干燥根；生甘草饮片购自于北京友谊医院中药房，经赵奎君教授鉴定为豆科植物胀果甘草的干燥根。
无水乙醇，纯净水；天门冬氨酸氨基转氨酶检测试剂盒；丙氨酸氨基转氨酶检测试剂盒；血清白蛋白检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
大鼠白介素1β酶联免疫试剂盒 (rat interleukin 1β ELISA Kit)，批号(W07036997)；大鼠白介素6酶联免疫试剂盒 (rat interleukin 6 ELISA Kit)，批号(W09036996)；大鼠肿瘤坏死因子α酶联免疫试剂盒(TNFα ELISA kit )，批号(U27036998)(Cusabio)。
2方法
21样品制备
, 百拇医药
211雷公藤提取物称取适量雷公藤生药材，打粉机打碎成粗颗粒状，8倍体积60%乙醇超声提取3次，合并滤液，减压浓缩回收乙醇，真空干燥得粗提物，雷公藤提取率为762%， 临用前用去离子水配制成相应浓度 (按雷公藤生药量配制)。
212甘草汁炮制雷公藤样品制备称取适量雷公藤生药材(打粉机打碎成粗颗粒状)及生甘草饮片，雷公藤甘草3∶1。
8倍体积的纯净水浸泡甘草饮片30 min，煎煮20 min，煎煮液滤出，相同步骤重复煎煮2次后合并滤液，浓缩至合适体积，甘草汁的量需能完全浸泡雷公藤，备用。
取制备好的甘草汁浸泡雷公藤生药材至甘草汁被完全吸收，置鼓风干燥箱干燥，取出后按211项提取，减压浓缩回收乙醇，真空干燥得粗提物，临用前用去离子水配制成相应浓度 (按雷公藤生药量配制)。
22动物分组
, 百拇医药
以下实验动物均由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，实验动物分笼饲养于解放军第三○二医院实验动物中心。每天上午 9∶00—10∶00 灌胃，正常组每天灌以等量生理盐水。
221小鼠预试验(给药剂量的确定) SPF级雄性小鼠50只，体重(20±2)g，正常饲养5 d，随机分成5组(n=10)，空白组、低剂量组(3 g·kg-1)、中剂量组(6 g·kg-1)、高剂量组(12 g·kg-1)和超高剂量(24 g·kg-1)(以雷公藤生药材计)，连续给药14 d。
222甘草汁炮制雷公藤減毒小鼠试验SPF级雄性小鼠30只，体重(20±2) g，正常饲养5 d，随机分成3组 (n=10)，空白组、雷公藤组(15 g·kg-1)、甘草炮制雷公藤组(15 g·kg-1)(以雷公藤生药材计)，连续给药14 d。
223甘草汁炮制雷公藤减毒大鼠试验SD大鼠，SPF 级，(180±20)g，30只，正常饲养5 d，随机分成3组(n=10)，空白组、雷公藤组(15 g·kg-1)、甘草炮制雷公藤组(15 g·kg-1)(以雷公藤生药材计)，连续给药14 d。, http://www.100md.com(赵小梅 宫嫚 董捷鸣 王伽伯 肖小河 赵奎君 马致洁)
[关键词]雷公藤； 甘草； 炮制减毒； 肝毒性； 炎症因子
雷公藤Tripterygium wilfordii Hook F为卫矛科雷公藤属一年生藤本植物，最早记载于《神农本草经》，味苦、辛，性寒，有大毒，归肝、肾经。具有祛风除湿、舒筋活络、消肿止痛、杀虫解毒等功效。在临床上治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、红斑狼疮、肾病综合征等自身免疫系统疑难病症有良好的效果，疗效独特[12]，但由于雷公藤毒性较大，临床应用时不良反应时有发生，包括肾脏、生殖系统、肝脏、胃肠道、免疫系统及皮肤黏膜等，其中肝脏为其最常见的受累器官之一[34]，已严重制约其临床应用。
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历代文献对雷公藤炮制减毒方法的记载甚少，现代对其炮制的研究方法有净制、蒸制、加辅料(羊血)、灵芝双向发酵解毒等[57]，目前临床应用时，主要是对雷公藤进行净制，取毒性较小的木质部作为药用，但中毒及不良反应现象仍很突出。雷公藤加热炮制和辅料炮制减毒的现代研究也较少，且减毒效果不明显。现代研究表明，甘草具有保肝作用，甘草酸是其主要作用成分[8]。文献记载甘草常用于有毒中药的配伍及炮制[8]，甘草汁炮制是传统减消中药毒性的手段，有文献报道甘草配伍雷公藤能显著降低肝毒性，且已优化了最佳配伍比例，从化学角度证实了雷公藤配伍甘草对毒性成分含量和比例的影响[911]。为此，本研究以肝毒性中药雷公藤为研究对象，在甘草配伍雷公藤减毒的实验研究和临床应用基础上，拟结合现代研究成果，研究甘草炮制雷公藤减毒的作用及效果，以期为临床提供安全、有效、便于使用的雷公藤炮制品，同时为其他肝毒性中药研究提供参考和数据支持。
1材料
旋转蒸发仪(RE52AA)；水循环真空泵(上海知信实验仪器技术有限公司)；AL204电子天平(METTLER TOLEDO)；Gradient A10 MillQ超纯水器(美国Millipore 公司)；超声提取清洗器(KQ5200E)；真空冷冻干燥箱；OLYMPUS光学显微镜；冷冻离心机(Sigma，德国)；低速离心机(SE3614)；自动生化仪(mindray BS300)；酶标仪；水浴锅(AISITE)；电磁炉。
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雷公藤T wilfordii生药材购自福建三明，经首都医科大学附属北京友谊医院赵奎君教授鉴定，为卫矛科雷公藤的干燥根；生甘草饮片购自于北京友谊医院中药房，经赵奎君教授鉴定为豆科植物胀果甘草的干燥根。
无水乙醇，纯净水；天门冬氨酸氨基转氨酶检测试剂盒；丙氨酸氨基转氨酶检测试剂盒；血清白蛋白检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
大鼠白介素1β酶联免疫试剂盒 (rat interleukin 1β ELISA Kit)，批号(W07036997)；大鼠白介素6酶联免疫试剂盒 (rat interleukin 6 ELISA Kit)，批号(W09036996)；大鼠肿瘤坏死因子α酶联免疫试剂盒(TNFα ELISA kit )，批号(U27036998)(Cusabio)。
2方法
21样品制备
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211雷公藤提取物称取适量雷公藤生药材，打粉机打碎成粗颗粒状，8倍体积60%乙醇超声提取3次，合并滤液，减压浓缩回收乙醇，真空干燥得粗提物，雷公藤提取率为762%， 临用前用去离子水配制成相应浓度 (按雷公藤生药量配制)。
212甘草汁炮制雷公藤样品制备称取适量雷公藤生药材(打粉机打碎成粗颗粒状)及生甘草饮片，雷公藤甘草3∶1。
8倍体积的纯净水浸泡甘草饮片30 min，煎煮20 min，煎煮液滤出，相同步骤重复煎煮2次后合并滤液，浓缩至合适体积，甘草汁的量需能完全浸泡雷公藤，备用。
取制备好的甘草汁浸泡雷公藤生药材至甘草汁被完全吸收，置鼓风干燥箱干燥，取出后按211项提取，减压浓缩回收乙醇，真空干燥得粗提物，临用前用去离子水配制成相应浓度 (按雷公藤生药量配制)。
22动物分组
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以下实验动物均由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，实验动物分笼饲养于解放军第三○二医院实验动物中心。每天上午 9∶00—10∶00 灌胃，正常组每天灌以等量生理盐水。
221小鼠预试验(给药剂量的确定) SPF级雄性小鼠50只，体重(20±2)g，正常饲养5 d，随机分成5组(n=10)，空白组、低剂量组(3 g·kg-1)、中剂量组(6 g·kg-1)、高剂量组(12 g·kg-1)和超高剂量(24 g·kg-1)(以雷公藤生药材计)，连续给药14 d。
222甘草汁炮制雷公藤減毒小鼠试验SPF级雄性小鼠30只，体重(20±2) g，正常饲养5 d，随机分成3组 (n=10)，空白组、雷公藤组(15 g·kg-1)、甘草炮制雷公藤组(15 g·kg-1)(以雷公藤生药材计)，连续给药14 d。
223甘草汁炮制雷公藤减毒大鼠试验SD大鼠，SPF 级，(180±20)g，30只，正常饲养5 d，随机分成3组(n=10)，空白组、雷公藤组(15 g·kg-1)、甘草炮制雷公藤组(15 g·kg-1)(以雷公藤生药材计)，连续给药14 d。, http://www.100md.com(赵小梅 宫嫚 董捷鸣 王伽伯 肖小河 赵奎君 马致洁)