人参皂苷Rh2通过激活p38诱导K562细胞自噬凋亡的实验研究(1)
[摘要]为了研究人参皂苷Rh2对人白血病细胞K562的凋亡作用，并从自噬角度来探讨其机制。实验采用CCK8方法检测人参皂苷单体Rh2对人白血病K562细胞增殖抑制作用；流式细胞术检测细胞凋亡；Hoechest染色观察细胞核染色质的形态；吖啶橙和MDC染色观察Rh2对细胞自噬的影响；Western blot和RTPCR检测Rh2对白血病细胞自噬重要基因的表达的影响；运用自噬抑制剂(3MA)研究自噬对细胞增殖和凋亡的影响。CCK8显示人参皂苷Rh2在低浓度时能有效抑制白血病细胞增殖，且其抑制作用具有浓度和时间依赖性；FCM和Hoechest显示Rh2能增加细胞的凋亡和染色质呈凋亡形态改变；吖啶橙和MDC染色发现Rh2组细胞的绿色荧光增强，并出现大量酸性自噬小泡；Western blot和RTPCR结果发现Rh2能上调Beclin1，LC3A，LC3B，激活型Caspase3和pp38的表達；运用细胞自噬剂(3MA)会削弱Rh2对K562的增殖抑制和促凋亡作用。人参皂苷Rh2可能通过激活磷酸化的p38，诱导细胞自噬途径，从而抑制K562细胞增殖和促进凋亡作用。
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[关键词]人参皂苷Rh2； 白血病； 自噬； 凋亡
白血病是严重危害人类生命健康的造血系统恶性肿瘤，是国内十大高发恶性肿瘤之一。迄今，白血病的治疗仍主要采用传统的大剂量联合化疗，但此疗法副作用甚大，复发率很高，尤其对机体免疫与造血系统有极大的损害。因此，可以从传统的中药中寻找天然低毒的药物来治疗白血病。其中人参Panax ginseng CAMeyer是我国传统中草药，在肿瘤的治疗方面具有很高的药用价值[1]。S型人参皂苷单体Rh2[(S)Rh2]是人参中天然活性成分之一，是一种从红参中分离得到的原人参二醇型单糖链皂苷单体化合物，其毒性低，相对分子质量小，脂溶性好，具有很强的抗肿瘤活性[2]。
目前大家认为，细胞死亡包括3种类型：即坏死、凋亡和自噬性细胞死亡，其中，自噬是属于比较热门的Ⅱ型细胞程序性死亡方式[3]。细胞程序性死亡中，自噬可能比凋亡扮演更为主动和重要的角色。自噬在肿瘤细胞起到双刃剑作用，可以保护肿瘤细胞，也可以杀伤肿瘤细胞[4]。作者选取人红白血病K562细胞株作为研究对象，为了进一步弄清楚人参皂苷Rh2对白血病的药理作用，并从自噬途径研究人参皂苷Rh2促进人白血病细胞自噬凋亡机制，为Rh2应用于临床治疗白血病奠定实验和理论基础。
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1材料
11K562细胞株人红白血病K562细胞株购自上海ATCC细胞库。每次取对数生长期的K562细胞以5×108个/L接种于10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37 ℃，5%CO2饱和湿度下培养，每2～3 d传代或换液。
12药品Rh2购自成都曼斯特科技有限公司(纯度98%)，取200 μL DMSO加入20 mg Rh2使之充分溶解，配制成100 mg·L-1原液，-20 ℃冷冻保存。实验前用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液稀释成所需浓度。
13试剂胎牛血清，RPMI 1640培养基(美国Hyclone公司)；CCK8试剂盒(日本同仁化学研究所)；Annexin VPI双标凋亡检测试剂盒(南京凯基生物公司)；吖啶橙，MDC染液，3MA自噬抑制剂(美国Sigma公司)；MAPK通路抗体试剂盒，Beclin1，LC3A/B多克隆抗体(美国Cell Signaling Technology)；Bcl2，Bax多克隆抗体(美国Epitomics公司)。
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14仪器超净工作台(Sanyo)；倒置显微镜、倒置荧光显微镜(Olympus)；低温离心机(Sigma)；酶标仪，垂直电泳仪，电转仪，ChemiDocXRS化学发光成像系统，PCR仪(BioRad)；二氧化碳培养箱(Thermo)。
2方法
21CCK8 法培养对数生长期的K562细胞，以1×104 个/孔接种于96孔板中。分为空白对照组、药物组和本底对照组，每组设6个复孔，每孔200 μL，(S)Rh2 20～100 μmol·L-1；本底对照组：只加RPMI 1640培养液。培养24，48，72 h后，每孔加入10 μL CCK8检测液，轻轻摇匀，孵育25 h 后，用酶标仪(波长450 nm)检测每孔吸光度(A)，并计算细胞增殖抑制率和半数抑制浓度(IC50)。
22FCM检测早期凋亡培养对数生长期的K562细胞，调整细胞浓度分别至5×108 个/L，接种于6孔细胞培养板中。实验分为4组：Ⅰ组为空白对照组，正常培养；Ⅱ组加入(S)Rh2 60 μmol·L-1；Ⅲ组加入5 mmol·L-1的自噬抑制剂3MA；Ⅳ组同时加入(S)Rh2 60 μmol·L-1和3MA 5 mmol·L-1。每孔3 mL培养液，在37 ℃，5%CO2饱和湿度下培养24，48 h后，分别收集各组细胞，用预冷001 mol·L-1PBS(pH 72)洗涤2次，4 ℃ 1 200 ×g离心5 min。加入RNA酶和碘化丙啶(PI) 和Annexin V，置于冰上染色处理30 min，每组细胞2×104个，上流式细胞仪检测，重复实验3次。
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23Hoechst染色取对数生长期的K562细胞调整细胞密度为5×108 个/L，接种于6孔培养板。实验分组：空白对照组含01% DMSO的RPMI 1640完全培养液；药物组60 μmol ·L-1的Rh2培养48 h后，收集空白对照组和药物组细胞，用预冷PBS洗涤细胞2次，加甲醇乙醇(3∶1)固定液室温固定15 min；离心去除固定液加Hoechst染色液避光、室温染色30 min，PBS洗涤1次，调整细胞浓度，滴片，荧光显微镜下观察。
24吖啶橙染色K562细胞用人参皂苷(S)Rh2 60 μmol·L-1处理24 h后，收集细胞，新选配制的吖啶橙(2 μ·mL-1)，37 ℃避光孵育15 min，在EP管中，用PBS漂洗3次后，调整细胞浓度，取一滴细胞悬液滴到玻片上，待细胞沉积到玻片上时，吸去上层液体，封片置于荧光显微镜下观察酸性的自噬小泡。50%甘油封片，置于倒置荧光显微镜下观察、采图，实验重复3次。, http://www.100md.com(刘小霞 夏菁 唐家锋 周明华 陈地龙 刘泽洪)
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[关键词]人参皂苷Rh2； 白血病； 自噬； 凋亡
白血病是严重危害人类生命健康的造血系统恶性肿瘤，是国内十大高发恶性肿瘤之一。迄今，白血病的治疗仍主要采用传统的大剂量联合化疗，但此疗法副作用甚大，复发率很高，尤其对机体免疫与造血系统有极大的损害。因此，可以从传统的中药中寻找天然低毒的药物来治疗白血病。其中人参Panax ginseng CAMeyer是我国传统中草药，在肿瘤的治疗方面具有很高的药用价值[1]。S型人参皂苷单体Rh2[(S)Rh2]是人参中天然活性成分之一，是一种从红参中分离得到的原人参二醇型单糖链皂苷单体化合物，其毒性低，相对分子质量小，脂溶性好，具有很强的抗肿瘤活性[2]。
目前大家认为，细胞死亡包括3种类型：即坏死、凋亡和自噬性细胞死亡，其中，自噬是属于比较热门的Ⅱ型细胞程序性死亡方式[3]。细胞程序性死亡中，自噬可能比凋亡扮演更为主动和重要的角色。自噬在肿瘤细胞起到双刃剑作用，可以保护肿瘤细胞，也可以杀伤肿瘤细胞[4]。作者选取人红白血病K562细胞株作为研究对象，为了进一步弄清楚人参皂苷Rh2对白血病的药理作用，并从自噬途径研究人参皂苷Rh2促进人白血病细胞自噬凋亡机制，为Rh2应用于临床治疗白血病奠定实验和理论基础。
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1材料
11K562细胞株人红白血病K562细胞株购自上海ATCC细胞库。每次取对数生长期的K562细胞以5×108个/L接种于10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37 ℃，5%CO2饱和湿度下培养，每2～3 d传代或换液。
12药品Rh2购自成都曼斯特科技有限公司(纯度98%)，取200 μL DMSO加入20 mg Rh2使之充分溶解，配制成100 mg·L-1原液，-20 ℃冷冻保存。实验前用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液稀释成所需浓度。
13试剂胎牛血清，RPMI 1640培养基(美国Hyclone公司)；CCK8试剂盒(日本同仁化学研究所)；Annexin VPI双标凋亡检测试剂盒(南京凯基生物公司)；吖啶橙，MDC染液，3MA自噬抑制剂(美国Sigma公司)；MAPK通路抗体试剂盒，Beclin1，LC3A/B多克隆抗体(美国Cell Signaling Technology)；Bcl2，Bax多克隆抗体(美国Epitomics公司)。
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14仪器超净工作台(Sanyo)；倒置显微镜、倒置荧光显微镜(Olympus)；低温离心机(Sigma)；酶标仪，垂直电泳仪，电转仪，ChemiDocXRS化学发光成像系统，PCR仪(BioRad)；二氧化碳培养箱(Thermo)。
2方法
21CCK8 法培养对数生长期的K562细胞，以1×104 个/孔接种于96孔板中。分为空白对照组、药物组和本底对照组，每组设6个复孔，每孔200 μL，(S)Rh2 20～100 μmol·L-1；本底对照组：只加RPMI 1640培养液。培养24，48，72 h后，每孔加入10 μL CCK8检测液，轻轻摇匀，孵育25 h 后，用酶标仪(波长450 nm)检测每孔吸光度(A)，并计算细胞增殖抑制率和半数抑制浓度(IC50)。
22FCM检测早期凋亡培养对数生长期的K562细胞，调整细胞浓度分别至5×108 个/L，接种于6孔细胞培养板中。实验分为4组：Ⅰ组为空白对照组，正常培养；Ⅱ组加入(S)Rh2 60 μmol·L-1；Ⅲ组加入5 mmol·L-1的自噬抑制剂3MA；Ⅳ组同时加入(S)Rh2 60 μmol·L-1和3MA 5 mmol·L-1。每孔3 mL培养液，在37 ℃，5%CO2饱和湿度下培养24，48 h后，分别收集各组细胞，用预冷001 mol·L-1PBS(pH 72)洗涤2次，4 ℃ 1 200 ×g离心5 min。加入RNA酶和碘化丙啶(PI) 和Annexin V，置于冰上染色处理30 min，每组细胞2×104个，上流式细胞仪检测，重复实验3次。
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23Hoechst染色取对数生长期的K562细胞调整细胞密度为5×108 个/L，接种于6孔培养板。实验分组：空白对照组含01% DMSO的RPMI 1640完全培养液；药物组60 μmol ·L-1的Rh2培养48 h后，收集空白对照组和药物组细胞，用预冷PBS洗涤细胞2次，加甲醇乙醇(3∶1)固定液室温固定15 min；离心去除固定液加Hoechst染色液避光、室温染色30 min，PBS洗涤1次，调整细胞浓度，滴片，荧光显微镜下观察。
24吖啶橙染色K562细胞用人参皂苷(S)Rh2 60 μmol·L-1处理24 h后，收集细胞，新选配制的吖啶橙(2 μ·mL-1)，37 ℃避光孵育15 min，在EP管中，用PBS漂洗3次后，调整细胞浓度，取一滴细胞悬液滴到玻片上，待细胞沉积到玻片上时，吸去上层液体，封片置于荧光显微镜下观察酸性的自噬小泡。50%甘油封片，置于倒置荧光显微镜下观察、采图，实验重复3次。, http://www.100md.com(刘小霞 夏菁 唐家锋 周明华 陈地龙 刘泽洪)