基于高通量测序的玄参根部转录组学研究及萜类化合物合成相关基因的挖掘(1)
[摘要] 该研究应用新一代测序技术Illumina HiSeqTM4000在转录水平上对药用植物玄参根部进行测序，结合生物信息学方法开展基因功能注释和SSR位点搜索。通过测序，共获得65 602 036条原始序列。利用生物信息学软件拼接和组装序列，获得73 983条unigene，平均长度823 bp。序列同源性比较表明，56 389条unigene与其他物种具有不同程度的同源性。通过Swiss-Prot，GO，KEGG，COG比对注释，发现520条编码玄参次生代谢途径关键酶基因和191个相关转录因子。利用MISA软件在所有unigenes中共搜索到11 659个SSR位点，重复类型以二核苷酸为主。该研究所获得的参与次生代谢的关键基因可为研究玄参药用成分的生物合成和调控机制奠定基础，获得的大量SSR位点为后续研究玄参种质鉴定及遗传多样性研究提供参考。
[关键词] 玄参；转录组；高通量测序；萜类物质
[Abstract] To investigate the profile of gene function and search for SSR， a new technology of high-throughput Solexa / Illumina sequencing was used to generate the root transcriptome of Scrophularia ningpoensis， and 65 602 036 raw reads were obtained. Based on the bioinformatics analysis and Trinity， 73 983 unigenes were obtained with an average length of 823 bp. The comparison of sequence homology in database showed that 56 389 unigenes had different degrees of homology. A total of 520 metabolic pathways related genes and 191 related transcription factors were identified by the Swiss-Prot， GO， KEGG and COG.The 11 659 SSRs were found by MISA and the highest frequency was AG/CT. In this study， we obtained numerous SSRs to provide references for the study of functional gene cloning and genetic diversity of S. ningpoensis. The key genes involved in the secondary metabolism are the basis for the study of biosynthesis and regulatory mechanism of the secondary metabolites.
, 百拇医药
[Key words] Scrophularia ningpoensis；transcriptome；high throughput sequencing；terpenoids
玄參为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根。玄参为我国常用中药材，始载于《神农本草经》，列为中品，历代药典都有收载。味甘、苦、咸、微寒，具有清热凉血，滋阴降火，解毒散结等功效[1]。研究发现玄参含有环烯醚萜、苯丙素、多糖等多种化学成分，具有保护心脑血管系统、抗炎、增强免疫等药理活性[2]。长期以来，由于玄参分子生物学相关研究起步较晚，缺乏玄参生长发育相关的分子标记开发、遗传图谱构建以及次生代谢途径等基础性研究成果的支撑，玄参分子育种、药效成分合成研究进展缓慢。高通量测序技术的出现，为研究玄参生长发育及次生代谢的分子机制提供了重要的基因资源，并为开展玄参功能基因组学研究提供了全新的思路和方法[3-4]。
高通量转录组测序技术已广泛应用于生物体转录组基因表达分析，采用该技术能全面快速地获取研究对象在某一状态下基因转录信息，从中挖掘重要功能基因，揭示不同生物学性状的分子机制[5-7]。开展玄参转录组的研究，也可能发现一些与其药效活性成分生物合成相关的候选基因，为玄参药效资源的充分利用奠定基础。本研究拟在转录水平上，利用Illumina HiSeqTM4000测序技术构建玄参根系转录组数据库，获得玄参转录本信息，并进行功能注释及SSR位点分析，揭示玄参根系转录组的整体表达特征，为进一步揭示玄参有效成分的累积、道地性形成等生物学过程的分子生物学研究提供丰富的数据资源。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 样品 药用植物玄参块根采自重庆市武隆县仙女山玄参GAP种植基地，采集时间为2015年8月初(块根膨大期)，经重庆市中药研究院李隆云研究员鉴定为玄参科玄参属植物玄参S. ningpoensis。选择生长健壮无病害的玄参植株，纯水洗净整个块根，用灭菌后的吸水纸吸干表面水分，迅速将块根切成约5 mm厚的薄片，立即用液氮速冻，后放入-80 ℃冰箱保存备用。
1.2 RNA的提取与转录组测序 采用 Trizol Reagent (Invitrogen)法提取玄参根总RNA，使用Agilen2100生物分析仪和NanoDrop分光光度计对提取的总RNA进行质量检测。总RNA质检合格后，用带有Oligo (dT)的磁珠富集真核生物mRNA加入fragmentation buffer，将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用6碱基随机引物(random hexamers)反转录合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase Ⅰ合成双链cDNA链，经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加poly (A)并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小筛选，接着进行PCR扩增，构建好的文库用Illumina HiSeqTM4000进行测序。, 百拇医药(潘媛 陈大霞 宋旭红 张雪 李隆云)
[关键词] 玄参；转录组；高通量测序；萜类物质
[Abstract] To investigate the profile of gene function and search for SSR， a new technology of high-throughput Solexa / Illumina sequencing was used to generate the root transcriptome of Scrophularia ningpoensis， and 65 602 036 raw reads were obtained. Based on the bioinformatics analysis and Trinity， 73 983 unigenes were obtained with an average length of 823 bp. The comparison of sequence homology in database showed that 56 389 unigenes had different degrees of homology. A total of 520 metabolic pathways related genes and 191 related transcription factors were identified by the Swiss-Prot， GO， KEGG and COG.The 11 659 SSRs were found by MISA and the highest frequency was AG/CT. In this study， we obtained numerous SSRs to provide references for the study of functional gene cloning and genetic diversity of S. ningpoensis. The key genes involved in the secondary metabolism are the basis for the study of biosynthesis and regulatory mechanism of the secondary metabolites.
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[Key words] Scrophularia ningpoensis；transcriptome；high throughput sequencing；terpenoids
玄參为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根。玄参为我国常用中药材，始载于《神农本草经》，列为中品，历代药典都有收载。味甘、苦、咸、微寒，具有清热凉血，滋阴降火，解毒散结等功效[1]。研究发现玄参含有环烯醚萜、苯丙素、多糖等多种化学成分，具有保护心脑血管系统、抗炎、增强免疫等药理活性[2]。长期以来，由于玄参分子生物学相关研究起步较晚，缺乏玄参生长发育相关的分子标记开发、遗传图谱构建以及次生代谢途径等基础性研究成果的支撑，玄参分子育种、药效成分合成研究进展缓慢。高通量测序技术的出现，为研究玄参生长发育及次生代谢的分子机制提供了重要的基因资源，并为开展玄参功能基因组学研究提供了全新的思路和方法[3-4]。
高通量转录组测序技术已广泛应用于生物体转录组基因表达分析，采用该技术能全面快速地获取研究对象在某一状态下基因转录信息，从中挖掘重要功能基因，揭示不同生物学性状的分子机制[5-7]。开展玄参转录组的研究，也可能发现一些与其药效活性成分生物合成相关的候选基因，为玄参药效资源的充分利用奠定基础。本研究拟在转录水平上，利用Illumina HiSeqTM4000测序技术构建玄参根系转录组数据库，获得玄参转录本信息，并进行功能注释及SSR位点分析，揭示玄参根系转录组的整体表达特征，为进一步揭示玄参有效成分的累积、道地性形成等生物学过程的分子生物学研究提供丰富的数据资源。
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1 材料与方法
1.1 样品 药用植物玄参块根采自重庆市武隆县仙女山玄参GAP种植基地，采集时间为2015年8月初(块根膨大期)，经重庆市中药研究院李隆云研究员鉴定为玄参科玄参属植物玄参S. ningpoensis。选择生长健壮无病害的玄参植株，纯水洗净整个块根，用灭菌后的吸水纸吸干表面水分，迅速将块根切成约5 mm厚的薄片，立即用液氮速冻，后放入-80 ℃冰箱保存备用。
1.2 RNA的提取与转录组测序 采用 Trizol Reagent (Invitrogen)法提取玄参根总RNA，使用Agilen2100生物分析仪和NanoDrop分光光度计对提取的总RNA进行质量检测。总RNA质检合格后，用带有Oligo (dT)的磁珠富集真核生物mRNA加入fragmentation buffer，将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用6碱基随机引物(random hexamers)反转录合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase Ⅰ合成双链cDNA链，经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加poly (A)并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小筛选，接着进行PCR扩增，构建好的文库用Illumina HiSeqTM4000进行测序。, 百拇医药(潘媛 陈大霞 宋旭红 张雪 李隆云)