黄春刚 郭金栓 高丽霞

    缺血再灌注脑(I/R)损伤发生机制十分复杂，很多机制尚未能明了。现已认识到脑I/R可激活一系列分子反应，从而导致脑组织的损伤。环氧化酶-2(COX-2)在I/R脑损伤组织中表达增强，但COX-2在I/R中作用即COX-2与神经元凋亡的关系研究不多。本研究通过大鼠I/R模型，分析脑组织COX-2的表达，探讨COX-2在I/R中的作用，寻找临床治疗I/R的新途径。

    1 材料与方法

    1.1 材料 主要试剂:COX-2特异性抑制剂 NS398(Sigma-Aldrich，USA);细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士德公司);兔抗人COX-2单克隆抗体(福州迈新生物技术有限公司);DAB显色试剂盒(福州迈新生物公司)。

    1.2 动物分组及模型的制备 实验动物为健康雄性SD大鼠，8～12周龄，体重250～300 g，购自河南省实验动物中心。随机分为对照组12只、假手术组12只、I/R组84只、I/R+NS39824 h组12只，其中I/R组分为脑缺血1 h再灌注15min、2 h、6 h、24 h、2 d、4 d、16 d。I/R 组:参照 Zea-Longa 等的颈外动物线栓法建立MCAO动物模型[1]。I/R+NS398组:术前30min腹腔注射NS398(5mg/kg，溶于5mg/ml DMSO);假手术组:假手术组线栓仅插入1cm;对照组:注射与抑制剂组等体积的DMSO。I/R模型制作完成后观察大鼠行为，采用Longa的5级神经缺陷评分法对大鼠进行神经功能评分，以判断模型是否成功。

    1.3 标本采集 麻醉后的大鼠仰卧位固定，开胸，暴露心脏，行左心室穿刺入升主动脉，剪开右心耳，肝素0.9%氯化钠溶液经左升主动脉冲洗内脏血液，4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液经心灌流固定，待大鼠全身僵硬后，断头取出脑组织，置于4%多聚甲醛中固定24 h。固定脑组织标本，修块后进行常规脱水，石蜡包埋，标本取材范围为额极6mm处，行冠状面连续切片，切片厚度为5 μm。

    1.4 TUNEL法 石蜡切片脱蜡。0.01 mol/L PBS冲洗后滴加蛋白酶 K胃蛋白酶复合消化液 1滴 ......