黄磊 石冰 宋庆高 王龑 郑谦

    哺乳动物继发腭的发育是一个复杂过程，涉及到将口鼻腔正确分离的几个过程的协调一致，从腭突产生(胚胎12 d)、上抬(胚胎13 d)到两侧腭突相对运动接触直至融合(胚胎14 d)，最后覆盖在口腔侧和鼻腔侧的黏膜分别分化为复层鳞状上皮和假复层纤毛状上皮，这些过程中任何一个环节发生改变都可引起腭裂。目前发现titf2和重组人转化生长因子β3(TGFβ3)基因突变与这种先天畸形密切相关。Titf2-/-小鼠[1]和人类甲状腺转素因子-2(TTF-2)[2，3]基因纯合缺陷表现为腭裂及甲状腺发育不全等畸形，TGFβ3-/-小鼠和人TGFβ3突变也可引起腭裂。在小鼠发育过程中，TTF-2有促进甲状腺前体细胞迁徙，抑制甲状腺前体细胞在迁徙过程中分化功能[4]，但对腭中嵴上皮细胞迁徙是否有影响，尚不清楚。TGFβ3主要在腭中嵴上皮细胞表达，在腭突黏附时起关键作用。本研究旨在观察在继发腭发育过程中，TTF-2和TGFβ3相互作用变化规律。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物 (1)成年C57BL/6J小鼠购自四川大学华西医学中心动物中心，雌鼠4～6周，体重12.0～14.5 g，雄鼠>6周龄，体重>20 g，保持12 h昼夜周期制，室温控制在20～25℃，充足食物，自由饮水(pH值为5)。(2)按雌雄比例2∶1于头晚20∶00至次日晨8∶00合笼，并于次日晨检查雌鼠，有阴道栓者为交配阳性，定此日为妊娠零天，记为受孕天数GD0。(3)于妊娠12、13、14 d分别断颈处死各6只鼠，无菌条件取出胚胎，用眼科剪解离腭突。

    1.2 主要试剂 TTF-2羊抗小鼠多克隆IgG购自Santa Cruz，Actin(I-1q)羊抗小鼠多克隆IgG购自Santa Cruz，产品编号SC-1616，Protein DetecterTMWestern Blot Kit BCIP/NBTSystem 购自KPL公司(产品号55-11-50)，SABC-AP免疫组化试剂盒购自博士得公司，产品编号:SA105，APES购自中山公司产品编号ZII-9001、组织细胞蛋白裂解液RIPA购自上海申能博彩生物科技有限公司。

    1.3 组织蛋白提取 (1)每100毫克腭突组织加入1 ml RIPA和10μl PMSF ......