王舒新 李勇

    瘦素为正处在研究阶段的对关节软骨的损伤修复可能有积极作用的药物。本研究旨在构建藻酸盐-软骨细胞三维培养体系的基础上，研究瘦素对软骨细胞及其细胞外基质的影响，并探讨其相关基因表达的变化，以期为软骨损伤和退变寻找一种新的治疗手段。

    1 材料与方法

    1.1 材料 软骨细胞取自2只健康4周龄Sprague-Dawley大鼠(购于北京维通利华实验动物技术有限公司)膝关节，体重(100±15)g，雌雄不限，清洁级。

    1.2 主要试剂 胎牛血清(天津血研所)，DMEM培养基、胰蛋白酶(Sigma公司)，青霉素、链霉素(华北制药有限公司)，胶原酶Ⅱ(Sigma公司)，SABC试剂盒(博士德公司)，胰酶(Gibco公司)，海藻酸钠粉剂(Fluka公司)。

    1.3 SD大鼠的软骨细胞分离及扩增 取4周大鼠膝关节软骨，剪成<1mm3大小，经0.25%胰酶消化后加入0.2%Ⅱ胶原酶5 ml、37℃恒温水浴振荡箱下消化60～90 min，离心后，收集骨髓中的单个核细胞，接种于25 cm2培养瓶中，3 d后换液，此后每2～3天换液。倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。待原代细胞达80%融合后，用0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶2传代。

    1.4 软骨细胞的鉴定 软骨细胞呈星形、多角形，铺路石样生长;HE染色观察软骨细胞形态，Ⅱ型胶原免疫组织化学检测方法观察软骨细胞中Ⅱ型胶原分泌情况。

    1.5 与海藻酸钠结合成软骨-藻酸钙复合体 将P2代细胞消化离心收集，使用低黏滞度的海藻酸钠溶液悬浮细胞，调整细胞密度至5×106/ml，充分混匀。软骨细胞/海藻酸钠混合物在102 mmol/L CaCl2中聚合约15 min形成固体小珠(图1)，于完全培养基中培养，加入不同浓度瘦素，依据培养液中不同浓度瘦素(0、1、10、100、1 000 ng/ml)分为 A、B、C、D、E 共5 组，将海藻酸钙珠置于5%CO2饱和湿度、37℃培养箱中培养，每日或隔日换液。分别于培养24 h取海藻酸钙凝珠进行以下检测:(1)MTT检测法检测细胞活性;(2)Realtime PCR定量研究IGF-ⅠmRNA表达，分析评价软骨细胞分泌的功能。 ......