谢延平 刘利 刘振武 颜继英 杨朝晖 刘炳智 江丽强

    近年来随着分子生物学等相关学科的飞速发展，基因工程作为一种治疗手段越来越被广泛应用于外科领域。该项目的研究，就是运用当今的分子生物学技术，采用重组质粒载体基因转染模型动物腰椎间盘髓核细胞，定量的观察基因的有效表达，从而为椎间盘退变的基因治疗提供实验依据。

    1 材料与方法

    1.1 材料 重组质粒DNA(15 μl TGF-β1 cDNA，克隆在 EcoRⅠ位点，购于上海第二军医大学微生物实验室)，质粒快速提取试剂盒(购于北京鼎国生物技术有限公司)，大肠杆菌JM109菌液(购于上海生工生物技术有限公司)，EcoRⅠ内切酶、蛋白Marker(购于北京鼎国生物技术有限公司)，胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉(购于美国sigma生物技术有限公司)，TGF-β1兔抗兔一抗(购于武汉博士德生物技术有限公司)，IgG鼠抗兔二抗(购于北京中山生物技术有限公司)。

    1.2 构建椎间盘退行性变的动物模型 选择健康成年的新西兰大白兔21只，雌雄不拘，用20%的乌拉坦4 ml/kg静脉注射麻醉实验动物后，采用腰椎侧前方倒八字手术入路，于腹膜外显露腰椎间盘，用髓穿针于 L3～4，L4～5，L5～6间隙各注入 20 μl 0.9%氯化钠溶液，并于L3～4所对应的腰大肌处以黑色丝线做标记，术后8周随机处死1只实验动物，检测退变程度。

    1.3 重组质粒DNA的扩增与提取 采用划痕法在平板培养基上接种大肠杆菌JM109菌液，37℃过夜培养，挑选单菌落于液体培养基中37℃剧烈摇震培养至OD260=0.3～0.4。采用CaCl2法制备大肠杆菌感受态，然后加入含有目的基因的质粒DNA，通过42℃热休克转化至大肠杆菌体内，继续于液体培养基中过夜培养。将培养好的菌液平铺于含有抗生素和X-gal、IPTG的平板培养基中，通过抗药性筛选及蓝白斑试验挑选所需的大肠杆菌菌株，继续于液体培养基中过夜培养。采用离心柱式快速回收提取质粒DNA的方法 ......