张旭 滕大才 徐铁军 高伟

    迄今为止，国内外研究已证实NMDA受体在脑缺血中介导的兴奋毒作用的危害，兴奋毒性可导致急性细胞死亡(坏死)，也可激起延迟类型的细胞死亡 (凋亡)[1-3]。现发现NMDAR至少存在7个亚单位[4，5]。其中，NR1亚单位是必需亚单位，2A和2B是主要的调节亚单位。因此把在缺血中起正性作用的亚单位作为靶目标，发展针对缺血性脑血管病的理想药物，而不干扰这些通道的正常生理功能，是目前和未来发展的趋势[6]。本研究针对缺血后大鼠海马NR2A mRNA的表达及蛋白变化情况，探讨其可能存在的关系，为进一步研究缺血性脑损伤的分子机制及研制和开发针对NR2A亚单位的特异性新药提供理论基础和形态学依据。

    1 材料与方法

    1.1 主要试剂、仪器及实验动物 寡核苷酸探针杂交试剂盒(博士德生物工程有限公司);2A免疫组化一抗(Santa Cruze)，DEPC和DAB(Sigma)公司;实验动物为健康雄性SD大鼠30只，体重250～300 g，由徐州医学院实验动物中心提供。

    1.2 动物分组及模型制作 实验动物随机分为3组:正常对照组(NC组，n=6)、假手术对照组(SC组，n=12)、缺血再灌组(IR组，n=12)。采用改良的四动脉阻断法(4 AO)建立短暂性前脑缺血(15 min)再灌注动物模型[7]，再灌时间为24 h和48 h。在确定的时间点进行灌注固定，满足以下条件的大鼠进入后续实验:(1)第1次手术后24 h动物清醒;(2)夹闭双侧颈总动脉后大鼠应:①挣扎<50 s;②翻正反射消失;③呼吸频率先快速上升，后下降并稳定在正常范围;④双侧瞳孔由小变大，由红变白;⑤角膜反射消失。SC组大鼠除不电凝椎动脉和不夹闭颈总动脉外，其他手术过程同IR组。

    1.3 灌注固定及切片制备 IR组在复灌后24和48 h与对应的NC组和IR组大鼠用20%水合氯醛(300～350 mg/kg)腹腔注射麻醉，经心-升主动脉插管灌注固定。在立体定位仪上将鼠脑冠状位分为前、中、后3段，取包含海马的中段入0.1 mol/L PBS(4℃，过夜)、入70%乙醇(4℃，过夜)。脱水:80%乙醇(1 h)，95%乙醇(1 h×2)，100%乙醇(1 h×2)，透明:二甲苯(0.5 h×2);浸蜡:62℃(1 h×2);石蜡包埋。将包埋的脑块作连续冠状切片，片厚8 μm，以45℃展片，70℃烤片3 h。切片分8套，分别进行焦油紫染色、NR2A原位杂交和免疫组化染色，TUNEL染色及阴性对照染色。

    1.4 IHC和ISH反应 IHC按ABC试剂盒说明书和本实验室方法进行[7] ......