乔芳 石翠英 何路军 王振雷 赵志弘 刘敬闪 张虹 田亚娟

    到目前为止，Rh血型系统是国际输血协会(ISBT)已确认的29个红细胞血型系统中最复杂、最具多态性的血型系统，主要包括 D、E、C、c、e 5 种抗原，D 抗原(ISBT004.001;RH1)的免疫原性最强，是临床上引起新生儿溶血病、溶血性输血反应的最重要的血型抗原[1]，其在红细胞上质和量的改变可产生弱D、部分D和Del型，统称为D变异型[2]。决定人类RH血型的RHD/CE基因位于染色体1p34.3～36.1，包括D基因和CE基因，分别由10个外显子组成，编码区总长均为1251bp，分别编码417个氨基酸组成的糖蛋白:D抗原和CcEe抗原。任何座位上的基因突变都可能改变抗原的蛋白结构[3]。通常RhD抗原的确认方法为抗人球蛋白(AHG)试验，但现已证实经抗人球蛋白试验鉴定的RhD阴性个体中存在RhD弱表现型:RhDel型。Del表型是一种变异的极弱RhD阳性血型，会引起Rh阴性受血者产生抗D抗体，因此，对于包括Del在内的极弱Rh阳性表型的研究成为热点。本研究采用吸收放散试验检测D抗原，鉴定出RhDel，再观察D基因存在情况。

    1 材料与方法

    1.1 材料 河北地区随机抽取2008至2010年期间河北省血液中心汉族RhD阴性献血者血样332份，无亲缘关系。

    1.2 血清学实验 按照中国输血技术操作规程确定所有样本的RhD、C、c、E、e抗原。3批抗-D血清来源:上海血液生物医药有限公司、德国BIOTEST公司、美国IMMUCOR公司。使用间接抗人球蛋白试验排除血样中的弱D和不完全D表型。剩余样本通过吸收放散实验筛选Del表型[4]。

    1.3 Rh吸收放散实验 IAT阴性样本用乙醚做吸收放散试验，以确定是否为Del型。

    1.4 基因组DNA提取 严格按照TIANGEN血液基因组DNA纯化试剂盒说明书操作，提取基因组DNA，紫外分光光度计检测OD260/OD280以确定DNA浓度及纯度。置于-20℃保存。

    1.5 RhD基因特异性外显子的PCR检测

    1.5.1 序列特异性引物(sequence specific primers，SSP)设计:根据文献Maaskant-van等[5]设计的RHD基因PCR引物体系，对 RHD 基因第3、4、5、6、7、9 特异性外显子进行等位基因特异性PCR扩增，另合成内对照引物HGH(human growth hormone，HGH) ......