吴川 王秀丽 王倩 刘彦涛 董蕊 刘朋

    糖尿病神经病理性痛(diabetic neuropathic pain，DNP)发病机制尚不完全清楚，可能与高血糖引起的神经营养与代谢障碍有关[1]，而细胞凋亡参与了糖尿病神经痛的发生发展[2]，但DNP大鼠脊髓背角神经元凋亡机制目前仍不十分清楚。本试验利用DNP大鼠模型，对脊髓背角的凋亡细胞及与之相联系的凋亡蛋白酶caspase-3进行了观察，以探讨在DNP的发展过程中，脊髓背角凋亡细胞及凋亡蛋白caspase-3的变化。

    1 材料与方法

    1.1 动物选择及分组 清洁级雄性SD大鼠60只，由河北医科大学动物试验中心提供，4周龄，体重150～170 g，室温20～25℃，昼夜交替，自由进食水，适应环境5 d进行试验。随机分为正常对照组(C组)和DNP组(D组)，每组30只。

    1.2 DNP模型的制备 参考文献[3]介绍的方法，禁食12 h后腹腔注射链脲霉素(STZ，批号:S0130，Sigma公司，美国)50 mg/kg，C组给予等容量0.9%氯化钠溶液。分别给予注射STZ 或0.9%氯化钠溶液后1、2、3 周采集尾静脉血样0.5 ml，采用酶学方法测定空腹血糖浓度，ACCU-CHEK血糖分析仪由德国Roche公司提供，D组空腹血糖浓度>16.7 mol/L为糖尿病模型制备成功，否则剔除，予以补充。采集血样后待大鼠安静后用Von Frey针测定机械缩足阈值;当缩足阈值低于4 g时为糖尿病神经痛模型成立;在腹腔注射后3、5、7周取L1～5节段脊髓组织，采用TUNNEL法和免疫组织化学法染色分别测定凋亡细胞与凋亡蛋白酶Caspase-3的表达。

    1.2.1 机械缩足阈值的测定:参照文献[3]介绍的方法，采用“up-and-down”方式，将大鼠置于金属网上，盖以透明的有机玻璃罩。使大鼠适应环境15 min，用一系列标准化的Von Frey针(Stoelting Wood公司，美国)垂直刺激大鼠后足底，使其弯曲成S形，持续8 s，在刺激时间内或在移开Von Frey丝时发生缩足反应，记为阳性反应，直至出现第1次阳性阴性(或阴性阳性)反应的骑跨，连续测4次。采用Dixon[4]介绍的方法计算50%缩足反应阈值。

    1.2.2 取材:分别于注射前、注射后3、5、7周每组各取10只大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉下，迅速开胸，经左心室至升主动脉插管，先以100 ml 0.9%氯化钠溶液洗去血液，随后用含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(0.1 mol/L ......