刘猛 董伟 冯晓洁 邓久鹏 戚孟春 李金源

    骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是目前刺激骨组织形成最强的生长因子，其生理效应是通过靶细胞表面Ⅰ型、Ⅱ型受体及胞内Smads信号通路来发挥的[1]。在Smads信号通路中，Smad6对BMPs信号传递起抑制作用，形成了BMPs信号传递的自身负反馈调控机制[2-4];其单独或与其它协同抑制子(如Smad泛素化调节因子-1，smad ubiguitin regulatory factor-1，Smurf1)一起，可以影响其他 Smads分子(如Smad5)的信号传递[5，6]。本研究在前期构建的小鼠 Smad6慢病毒干扰载体的基础上，探索Smad6信号干扰对小鼠间充质干细胞(MSCs)骨向分化中Smad5及Smurf1基因表达的影响，从而进一步揭示应用Smad6信号干扰促进BMP-2诱导的MSCs骨向分化的分子机制。

    1 材料与方法

    1.1 主要材料与试剂 携带绿色荧光蛋白(GFP)的重组干扰载体 pGCSIL-GFP-Smad6，为自行构建[7]。D/F12 小鼠骨髓MSCs专用培养基，购自广州赛业;胎牛血清购自hyclone公司;Percoll分离液购自美国PHAMACIA公司;人重组BMP-2购自北京博奥森生物技术有限公司。TrizolTMRNA Isolation Reagent，美国Gibco BRL 公司;iQ SYBR Green supermix，美国 Bio-Rad公司;上下游引物，上海生工合成。兔抗鼠单克隆抗体(一抗)，购自美国SANTA CRUZ公司。

    1.2 重组干扰载体对间充质干细胞(MSCs)的转染及骨向分化 密度梯度离心法培养小鼠骨髓MSCs[8]，应用含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养。取第三代MSCs用于本实验。实验分为A、B、C 3组:A组，细胞作为对照组;B组，空白载体转染+BMP-2诱导;C组，重组干扰载体转染+BMP-2诱导。转染病毒液均为50 μl/孔。转染前更换培养基，换用无血清的培养基，使细胞同步化。应用病毒载体转染B、C 2组MSCs，转染第72小时后，更换新鲜培养基，荧光显微镜下观察;并用200 ng/ml的rhBMP-2对小鼠骨髓MSCs进行骨向诱导。于BMP-2诱导第6、24小时两个时间点收获细胞，进行相关检测。

    1.3 SyberGreen实时荧光定量PCR检测Smurf1的基因表达水平 参照NCBI Genebank中小鼠Smurf1和GAPDH基因序列 ......