潘国强 齐凤平 王相利

    骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，是存在于骨髓中非造血干细胞的另一种具有多分化潜能的干细胞。因具有强大的增殖能力和多向分化潜能，MSCs成为现代生物学和医学领域研究的热点。2000年 Woodbury等[1]首次将MSCs在体外诱导分化为外胚层起源的神经元样细胞。随后，国内外均有实验证明了这一点，这为临床神经系统疾病的细胞治疗开启了一片光明[2]。但对于MSCs诱导分化为神经元样细胞的确切机制目前还不清楚。金雀异黄素(Genistein)是一种异黄酮类的植物雌激素，在蚕豆中广泛分布，具有弱雌激素的生物活性，是一种特异性的酪氨酸蛋白激酶抑制剂，Ca2+作为细胞内第二信使参与许多生命活动过程，如细胞代谢、增殖等。为探讨使用金雀异黄素阻断酪氨酸激酶能否对细胞内Ca2+有影响及金雀异黄素对MSCs分化为神经元样细胞过程中细胞内相关蛋白有无变化，本试验进一步研究骨髓间充质干细胞诱导分化的机制。报告如下。

    1 材料与方法

    1.1 材料 培养细胞、免疫组化和激光扫描共聚焦显微镜实验在华北煤炭医学院中心实验室完成。实验用材料:L-DMEM培养基(Sigma)、胎牛血清 FBS(Hyclone)、Percoll分离液(Sigma)、胰蛋白酶(Amersco)、DEPC(Amersco)、Trizol(invitrogen)、SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 骨髓间充质干细胞的分离和培养:取健康成年SD大鼠(雄性，150～200 g，清洁级，由中国药物检定所动物中心提供)，无菌条件下取出双侧股骨和胫骨，用含10%FBS的LDMEM，反复冲洗骨髓腔，冲出骨髓后充分混匀，离心后弃上清及脂肪层，沉淀用L-DMEM培养基混匀，轻轻叠加到密度为1.073 g/ml的Percoll分离液上，离心后取乳白色单核细胞层(中间界面层)，再用L-DMEM混匀离心洗涤两次，细胞沉淀中加入 L-DMEM(含10%FBS)，记数细胞，调整密度，按1×109密度接种于一次性塑料培养瓶中，置于CO2孵箱中培养，48 h后首次换液，弃掉未贴壁细胞。以后每3天换1次液。待培养的细胞增殖接近融合状态时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，按1∶2比例传代培养。倒置相差显微镜观察不同时期细胞生长情况。

    1.2.2 骨髓间充质干细胞的诱导分化:细胞传至第5代，待细胞融汇成致密单层后，去除培养液，以0.01 mol/L PBS(pH值7.4)冲洗3 次 ......